劉璐菘，劉文俊，許欣竹，馬 丹，王凌志，于化新，劉慧慧，單德紅

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心 沈陽 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學教學實驗中心 沈陽 110847；3. 遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 沈陽 110847）

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為脾胃相表里，脾氣虛時胃氣亦虛，因此胃主受納和腐熟水谷等功能也會受損。現(xiàn)代醫(yī)學認為，胃黏膜存在主細胞、壁細胞和G 細胞等多種內(nèi)、外分泌細胞，其合成釋放的胃液和多種胃腸激素廣泛參與消化吸收。研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛時胃酸、胃蛋白酶原、胃泌素、胃動素和血管活性腸肽等分泌減少[1-5]，胃黏膜細胞的線粒體損傷[6,7]。由于線粒體在胃液和胃腸激素的合成與釋放中發(fā)揮重要作用[8,9]，因此其損傷與脾氣虛胃黏膜細胞的內(nèi)、外分泌功能下降有關，但其損傷機制不明。

線粒體為網(wǎng)狀細胞器，對外來刺激極為敏感，但細胞可啟動線粒體自噬機制，及時清除異常個體，從而維護其網(wǎng)絡健康。線粒體產(chǎn)能主要依賴于呼吸鏈復合物（respiratory chain complex，RCC）的氧化磷酸化，其副產(chǎn)品還有線粒體膜電位（ΔΨm）。5 種RCC 中的4種由線粒體DNA和核DNA 共同編碼，但前者易突變，常導致部分線粒體ΔΨm 下降，但細胞可通過PTEN 誘 導 激 酶 1（PTEN-induced putative kinase protein 1，PINK1）-Parkin 通路，啟動線粒體自噬機制，及時識別并隔離異常線粒體，進而為溶酶體降解清除[10]。線粒體自噬過程復雜，受眾多自噬相關蛋白嚴密調(diào)控，因此某些關鍵蛋白表達常用來評價其發(fā)生水平，如微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）-II 和選擇性自噬接頭蛋白p62 等[11]。本研究主要采用電鏡和分生等技術(shù)，圍繞線粒體超微結(jié)構(gòu)、呼吸鏈狀態(tài)和自噬等，探討脾氣虛胃黏膜細胞線粒體損傷的可能機制。

1 材料

1.1 動物

將SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（220 ± 10）g，共計16 只，購自本溪長生生物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK（遼）-2010-0001），適應性飼養(yǎng)（室溫（22 ±1）℃，相對濕度45%-55%，自由進食水）1周后復制脾氣虛證動物模型。本研究方案通過遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核（20151205）。

1.2 倫理審查

項目通過遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核，批準號：20151205。

1.3 試劑

線粒體呼吸鏈復合物I-IV 檢測試劑盒（批號：20171120，Solarbio）、BCA 法蛋白測定試劑盒、EasySee Western Blot 發(fā)光液（批號：K20316、10419，TransGen）、ATP 含量測定試劑盒（批號：201901，南京建成生物工程研究所）、抗RCC V多克隆抗體和抗p62多克隆抗體（批號：00007313，00010203，Proteintech）、抗 PINK1 多克隆抗體和抗Parkin多克隆抗體（批號：GR248843-1，GR281377-1，Abcam）、抗LC3-II 多克隆抗體（批號：00040972，Proteintech）、GAPDH（ 批 號 ：20817，TransGen）。

1.4 主要儀器

酶標儀（美國，iMark），蛋白印跡和和電泳儀（美國，Bio-Rad）、高速冷凍離心機（美國，Thermo Scientific）、顯影儀（中國，Tanon）。

2 方法

2.1 分組、模型復制及評價

大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組和脾氣虛證模型組（模型組），每組8 只。按文獻[12]復制和評價飲食失節(jié)+勞倦型脾氣虛證大鼠模型。

2.1.1 模型建立

模型組在15日內(nèi)①先飽食1日，再禁食2日，不禁水，共5個循環(huán)；②每日水溫35-37℃游泳至力竭。

2.1.2 模型評價標準

①消瘦：體質(zhì)量明顯下降為達標；②食少：代謝籠計量24 h 單只進食量和飲水量，均明顯減少為達標；③神疲：檢測大鼠5 min 內(nèi)在曠場實驗中的運動距離和站立次數(shù)，顯著下降為達標；④乏力：四肢抓力明顯變小為達標。⑤毛發(fā)枯槁：三人分別判斷，結(jié)論一致為達標。

2.2 胃黏膜細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

二組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.0035 mL·g-1）麻醉，剖腹取胃，4℃鹽水洗凈，部分切成約1 mm3，按文獻方法[13]處理后，電鏡觀察胃黏膜細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化并拍片，每例計數(shù)6 個不同視野下嵴減少的線粒體數(shù)量。

2.3 胃黏膜細胞線粒體呼吸鏈狀態(tài)評價

同2.2 法取洗凈后胃組織，分離胃黏膜層并置于線粒體保護液中，玻璃勻漿器充分勻漿后離心（1 kg，5 min，4℃），棄除沉淀，將上清同法再次離心，吸取上清再次離心（1.2 kg，10 min，4℃），向沉淀物中加入100 μL預冷PBS（pH7.4）制成線粒體混懸液；其次，采用JC-1法，將線粒體懸液與JC-1 沖洗緩沖液混合，用紅色熒光/綠色熒光比值表示ΔΨm；最后，取線粒體懸液，按文獻采用比色法檢測ATP 和呼吸鏈RCCI-IV 活性[14]。所有操作均嚴格按照說明書操作。

2.4 相關蛋白表達

參照文獻所載Western blot 檢測方法[15]，簡述如下：剪碎胃黏膜組織后加入線粒體蛋白裂解液，冰浴充分勻漿后靜置30 min，離心（1.4 kg, 10 min, 4℃）取上清；BCA 蛋白定量，以25 μg 上樣調(diào)整并計算加樣量；2 × SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液100℃煮沸5 min，加樣，10%分離膠SDS-PAGE 電泳90 min；轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉/TBST 室溫封閉1 h；分別加入RCCV（1∶2000）、PINK1（1∶1000）、Parkin（1∶1000）、LC3-I（1∶5000）、LC3-II（1∶2000）和 p62（1∶2000）及 GAPDH（1∶5000）等抗體，4℃搖床16 h；TBST 洗膜后二抗室溫孵育1 h；TBST 洗膜后加入發(fā)光顯影，應用AlphaView SA 軟件計算目的條帶相對于內(nèi)參的表達量，再計算模型組相對于正常組表達量的百分比（除CV），以方便制圖。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

動物模型復制過程中未有死亡及脫失。通過模型評價發(fā)現(xiàn)模型組大鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量下降、進食減少、神疲乏力以及毛色枯槁無華等，實驗結(jié)果表明動物模型復制成功[13-15]。

圖1 二組胃黏膜細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

表1 二組胃黏膜細胞線粒體嵴減少線粒體數(shù)量()

表1 二組胃黏膜細胞線粒體嵴減少線粒體數(shù)量()

注：與正常組比較，**P ＜ 0.01。

嵴減少線粒體數(shù)/個1.90±0.45 6.43±2.29**組別（n=3）正常組模型組

3.1 胃黏膜層線粒體形態(tài)

圖1可見，二組均可見較多卵圓形線粒體，輪廓清楚，大小比較一致，內(nèi)部的嵴較清晰，但模型組可見大量嵴減少現(xiàn)象（見圖1 中*），二組嵴減少線粒體數(shù)量見表1。

3.2 胃黏膜細胞線粒體呼吸鏈基本狀態(tài)

表 2 可見，與正常組比較，模型組 ΔΨm 和 ATP 水平下降，CI 和CIV 活性及CV 表達降低，均有統(tǒng)計學意義，但RCCII和III活性變化不明顯，無統(tǒng)計學差異。

3.3 胃黏膜細胞線粒體自噬相關蛋白表達

圖2可見，模型組PINK1、Parkin、LC3-I、LC3-II和p62 表達分別為正常組的 68.69% ± 0.84%，72.67% ±4.74%，134.16% ± 2.27%，69.61% ± 3.07%，121.83% ±4.65%，其中PINK1、Parkin 和LC3-II表達水平下降，而LC3-I和p62表達升高，均有統(tǒng)計學意義。

4 討論

線粒體是網(wǎng)狀細胞器，不僅是細胞的動力工廠，對于胃腸道的內(nèi)、外分泌細胞內(nèi)來說，還協(xié)同高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等完成胃蛋白酶原和多數(shù)激素的合成、儲存與釋放，而其損傷又會誘發(fā)氧化應激和細胞凋亡，因此胃黏膜細胞線粒體健康對于消化吸收影響極大[16]。

脾氣虛胃黏膜細胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷早有報道[6-7]，本研究也觀察到類似現(xiàn)象，如模型組線粒體嵴明顯減少。由于線粒體產(chǎn)能依賴于其內(nèi)膜嵴上的呼吸鏈的氧化磷酸化反應，所以本研究進一步檢測了該類細胞線粒體呼吸鏈的基本情況。結(jié)果顯示，模型組的ATP和 ΔΨm 水平明顯降低，且 RCCI 和 IV 活性及 RCCV 表達降低，表明脾氣虛時胃黏膜細胞線粒體的呼吸鏈功能受損，此結(jié)果還未見報道。線粒體RRCI、III、IV和V均由線粒體DNA 和核DNA 共同編碼，但前者靠近氧化磷酸化場所，又缺少修復機制，極易為外來刺激所誘導而發(fā)生突變，從而干擾呼吸鏈功能，如不及時糾正，則會導致諸如ΔΨm下降和ATP合成減少等結(jié)果。

正常情況下，功能異常的線粒體可以分裂為健康和異常子代各一，前者融入原有網(wǎng)絡能夠維持線粒體的數(shù)量和質(zhì)量，而后者則應及時清除，否則將污染原有網(wǎng)絡，甚至發(fā)生氧化應激和細胞凋亡，因此及時降解異常線粒體個體就顯得極為重要[17]。線粒體自噬是細胞清除異常線粒體的重要機制，其介導途徑較多，目前研究較多的是PINK1-Parkin 通路[18]。研究顯示，ΔΨm 正常的線粒體可將胞漿中的PINK1 轉(zhuǎn)運入線粒體內(nèi)分解，而ΔΨm 下降會阻礙該過程，造成PINK1 堆積于線粒體外膜，再通過一些中間環(huán)節(jié)募集Parkin，從而促進異常線粒體被吞噬泡所包裹而形成自噬體，最終被溶酶體分解[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組的ΔΨm下降，但PINK1和Parkin表達均明顯低于正常組，表明脾氣虛時胃黏膜細胞的PINK1-Parkin 通路抑制。通常來說，ΔΨm 下降會導致PINK1 表達上升，但本研究中模型組PINK1 表達卻出現(xiàn)降低，推測可能是脾氣虛時胃黏膜細胞內(nèi)的PINK1 合成減少，或是線粒體轉(zhuǎn)運PINK1的機制增強，具體原因?qū)⒃谝院筇接憽?/p>

表2 二組胃黏膜細胞線粒體呼吸鏈情況()

表2 二組胃黏膜細胞線粒體呼吸鏈情況()

注：與正常組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

RCCV表達(n=4)0.70±0.09 0.36±0.11**組別正常組模型組ΔΨm(n=8)0.81±0.27 0.59±0.080**ATP（μmoL·g-1）(n=8)0.18±0.09 0.11±0.01**RCCI活性(n=8)15.27±4.76 12.61±4.09*RCCII活性(n=8)16.98±6.02 18.14±5.50 RCCIII活性(n=8)12.43±3.62 14.10±5.92 RCCIV活性(n=8)33.72±11.34 18.21±3.93**

圖2 胃黏膜細胞線粒體自噬相關蛋白表達

線粒體自噬因受眾多蛋白調(diào)控，所以部分蛋白表達水平可用來判定自噬的強弱。LC3-II 由LC3-I 轉(zhuǎn)化，主要表達于吞噬泡和自噬體的膜上，是最常用的自噬評價指標[20]。p62與LC3結(jié)合，常在自噬發(fā)生后被降解，因此可與LC3-II 配合反映自噬水平[21]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組LC3-I 表達較高，LC3-II 表達下降，而 p62 表達上升，分別提示 LC3-I 轉(zhuǎn)化為LC3-II減少和p62降解不足，由此推測，脾氣虛時胃黏膜細胞的線粒體自噬水平降低，可能難以及時清除異常的線粒體個體，從而導致整個網(wǎng)絡損傷。

綜上所述，本研究認為脾氣虛胃黏膜細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷與PINK1-Parkin 通路抑制所導致的線粒體自噬水平低下有關。