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基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析參桃軟肝丸治療肝細胞癌的機制*

2020-04-12 03:18:28何燦封李穗暉
關(guān)鍵詞:草素木犀槲皮素

何燦封 ,李穗暉

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510405;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣州 510405)

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma)是臨床中最常見且惡性程度最高的腫瘤之一,其發(fā)生率和死亡率在我國腫瘤疾病中分別位列第4 位及第3位,肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是其中最主要的病理類型,約占85%-90%以上[1]。肝細胞癌起病隱匿,早期臨床癥狀不明顯,多數(shù)患者確診時已屬局部晚期或伴有遠處轉(zhuǎn)移,且多數(shù)合并肝炎、肝功能及凝血功能異常而無法進行手術(shù),即使允許行手術(shù)治療,術(shù)后5 年復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍有40%-70%[1],后續(xù)治療效果不佳,預(yù)后極差。

參桃軟肝丸是國醫(yī)大師周岱翰治療肝癌的經(jīng)驗方,主要由人參、桃仁、當歸、仙鶴草、丹參、大黃、冬蟲夏草、人工牛黃組成,具有健脾養(yǎng)肝、軟堅消癥之功效,臨床上廣泛用于治療肝細胞癌,特別是乙肝病毒相關(guān)性肝細胞癌。臨床研究表明,參桃軟肝丸對于中晚期肝癌患者具有穩(wěn)定瘤體、提高生存質(zhì)量的作用,并且在改善患者肝區(qū)疼痛、腹脹、納呆、乏力癥狀有較好療效[2]。目前在參桃軟肝丸原方組成的基礎(chǔ)上開發(fā)出參桃軟肝膠囊[3],藥理研究表明參桃軟肝膠囊或通過抑制癌細胞生長、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤新生血管形成及改善機體免疫等方面發(fā)揮抗肝癌作用[4]。

為了探析參桃軟肝丸治療HCC 的機制,本文將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù),構(gòu)建參桃軟肝丸治療HCC 的“多成分-多靶點”網(wǎng)絡(luò),通過基因功能和通路富集分析確定參桃軟肝丸的藥理活性,并使用分子對接技術(shù)進一步研究參桃軟肝丸關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶標之間的相互作用,以期為參桃軟肝丸的臨床應(yīng)用提供依據(jù),并為今后深入的實驗研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 收集參桃軟肝丸的活性成分及靶點

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)中收集人參、桃仁、當歸、仙鶴草、丹參、大黃、冬蟲夏草、人工牛黃的成分,根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥ 30% 和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18 進一步篩選出活性候選成分,并獲取其相應(yīng)的靶點,同時刪除不含有靶點的活性成分。然后通過通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(universal protein,Uniprot,http://www.uniprot.org)將收集到的靶點轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名稱(gene symbol),其中物種來源限制為人(“Homo sapiens”),刪除物種來源不符合人的靶點。

1.2 篩選參桃軟肝丸治療HCC的潛在靶點

使用“hepatocellular carcinoma”作為關(guān)鍵詞檢索人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards(https://www.genecards.org),獲取與HCC 相關(guān)的疾病靶點后,與“1.1”中獲得的靶點取交集,最終獲得參桃軟肝丸活性候選成分治療HCC的潛在靶點。

1.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 軟件(版本3.7.1)構(gòu)建參桃軟肝丸治療HCC 的“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),同時采用CytoHubba 插件對該網(wǎng)絡(luò)進行關(guān)鍵成分分析。連接度(degree,是體現(xiàn)節(jié)點重要程度的參數(shù),即節(jié)點間相連的路徑數(shù)目),degree值高的活性成分被認為是參桃軟肝丸治療HCC的關(guān)鍵成分。

1.4 基因本體Gene Ontology, GO 分子功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

clusterProfiler 是R 語言中用于基因集合功能及通路途徑富集分析和可視化的軟件包。在R 語言(版本3.6.1)中調(diào)用clusterProfiler 包對“1.2”獲取的靶點進行GO分子功能和KEGG通路富集分析,其中篩選條件為P< 0.001。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及分析關(guān)鍵靶點

將“1.2”篩選獲得的靶點導(dǎo)入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析平臺 STRING 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/),其中物種來源限制為人(“Homo sapiens”),構(gòu)建蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),保存為“tsv”格式文件導(dǎo)出后,導(dǎo)入至Cytoscape軟件,采用CytoHubba插件對該網(wǎng)絡(luò)進行關(guān)鍵靶點分析,degree 值排名前5的靶點被認為是參桃軟肝丸的活性候選成分治療HCC的關(guān)鍵靶點。

1.6 分子對接

使用分子對接技術(shù)研究參桃軟肝丸關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點之間的相互作用,具體為分別從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(http://www.rcsb.org/)和有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載靶蛋白結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵成分結(jié)構(gòu)后,上傳至CB-Dock在線分子對接網(wǎng)站(http://cao.labshare.cn/cb-dock/),CB-Dock 可自動識別蛋白潛在結(jié)合位點,計算中心和大小后自定義對接口袋大小,并使用內(nèi)置的AutoDock Vina 軟件進行分子對接,以及對對接后結(jié)構(gòu)打分。完成上述操作后,使用R 語言的pheatmap 包繪制熱圖,并使用Maestro 11.9 軟件對上述對接結(jié)果中Vina 對接分值最佳的受體-配體結(jié)構(gòu)進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 參桃軟肝丸候選活性成分

從TCMSP中檢索人參、桃仁、當歸、仙鶴草、丹參、大黃、冬蟲夏草、人工牛黃的成分,根據(jù)閾值OB ≥30%和DL ≥0.18 進一步篩選,并去除重復(fù)成分后,共篩選出符合條件的候選成分113個(表1)。

2.2 參桃軟肝丸治療HCC的候選靶點

匯總候選成分在TCMSP 中相應(yīng)的靶點后,通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點名稱轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名稱,并剔除重復(fù)及非人類靶點后,共獲得271 個潛在靶點。檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到與HCC 相關(guān)的靶點共758個,前后兩者取交集,最終獲得參桃軟肝丸候選活性成分的潛在治療靶點共73個(表2、圖1)。

2.3 構(gòu)建中藥-活性成分-靶點

使用Cytoscape 軟件繪制參桃軟肝丸治療HCC 的“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,詳見圖2。該圖直觀反映了參桃軟肝丸多成分、多靶點治療HCC 的作用機制。CytoHubba 插件分析表明,quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)、kaempferol(山奈酚)是degree 值排名前三的活性成分,可認為是參桃軟肝丸治療HCC 的關(guān)鍵成分。

表1 參桃軟肝丸候選成分的具體信息

表2 參桃軟肝丸治療HCC的潛在靶點

圖1 參桃軟肝丸治療HCC靶點的篩選

2.4 GO分子功能富集結(jié)果

clusterProfiler 包對上述73 個潛在靶點基因的GO分子功能聚類結(jié)果表明,排名前30的富集結(jié)果涉及了細胞生長、細胞周期、細胞凋亡、抗氧化和多種蛋白激酶調(diào)節(jié)等多個分子功能的調(diào)節(jié)(圖3)。

2.5 KEGG通路富集結(jié)果

clusterProfiler 包對上述73 個潛在靶點基因的KEGG 通路富集分析表明,P值排名前50 條通路主要有乙型肝炎、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end product,AGE-RAGE)信號通路、膀胱癌、胰腺癌、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、肝細胞癌、非小細胞肺癌、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑耐藥以及丙型肝炎等(圖4)。

2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

通過STRING網(wǎng)站和Cytoscape軟件對參桃軟肝丸中治療HCC 的73 個靶點進行PPI 分析并作圖,CytoHubba 插件分析顯示degree 值排名前5 的靶點依次為:蛋白激酶B(protein kinase B,PKB or AKT1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3,CASP3)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、V-Jun 肉瘤病毒癌基因同源物(V-Jun sarcoma virus 17 oncogene homolog,JUN)、V-MYC 骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(V-Myc Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog,MYC),這些可認為是參桃軟肝丸治療HCC的靶點互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(圖5)。

圖2 參桃軟肝丸治療HCC的中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 參桃軟肝丸中治療HCC靶點的GO富集條形圖

圖4 參桃軟肝丸中治療HCC靶點的KEGG通路富集條形圖

2.7 分子對接

分子對接結(jié)果顯示,槲皮素、木犀草素、山奈酚等3 個關(guān)鍵成分與AKT1、CASP3、VEGFA、JUN、MYC 等5個關(guān)鍵靶點對接的Vina 分值<-7.0 的有13 對,其中Vina 分值<-9.0 有3 對,表明大部分關(guān)鍵靶點與關(guān)鍵成分的結(jié)合能力較強,而AKT1 蛋白與木犀草素相互作用的Vina分值(即結(jié)合能)最佳,為-9.80 kcal·mol-1,具體對接結(jié)果(圖6)。結(jié)合圖7可以看出,木犀草素與AKT1 蛋白之間通過 3 個 π-π 鍵和 1 個氫鍵形成較為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

3 討論

圖5 參桃軟肝丸中治療HCC靶點的互作網(wǎng)絡(luò)

圖6 分子對接結(jié)果

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建了中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)表明了參桃軟肝丸具有多成分、多靶點綜合作用的特點,其中關(guān)鍵成分可能為槲皮素、木犀草素、山奈酚。槲皮素、木犀草素和山奈酚均屬于植物來源類黃酮化合物,藥理研究發(fā)現(xiàn),它們對于HCC 具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡以及抑制其侵襲、轉(zhuǎn)移等方面的作用[5-8]。參桃軟肝丸活性成分治療HCC 所調(diào)控的靶點互作網(wǎng)絡(luò)表明,該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點很可能為AKT1、CASP3、VEGFA、JUN、MYC。GO 分子功能和KEGG 通路分析闡明了參桃軟肝丸多功能、多通路治療HCC 的機制,相關(guān)的通路有乙型肝炎、丙型肝炎 、磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/PKB or PI3K/Akt)信號通路、p53 信號通路、癌癥中微小 RNA(MicroRNAs)、細胞程序性死亡配體 1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)表達和細胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)檢查點途徑、細胞凋亡、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號通路 、白介素 -17(interleukin-17,IL-17)信號通路、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O(Forkhead box O,F(xiàn)oxO)信號通路等。

結(jié)合本文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果以及相關(guān)文獻回顧,參桃軟肝丸治療HCC 的潛在機制可進一步歸納為以下幾個方面:

3.1 抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡

3.1.1 抑制AKT1蛋白激活

圖7 AKT1蛋白與木犀草素之間相互作用的3D示意圖

AKT1(即AKT)是PI3K/AKT信號通路中重要的下游靶標,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,該家族蛋白參與生長因子、細胞因子等激活下游靶標的細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。AKT1 可通過抑制細胞凋亡而促使細胞存活[10]。AKT1的異常激活存在于多種癌癥中,可促進癌細胞的代謝、生長、增殖、存活以及血管生成[11]。AKT1的磷酸化激活被認為是HCC 侵襲性和預(yù)后不良的危險因素[12]。研究表明,參桃軟肝丸可通過抑制AKT1的磷酸化激活而發(fā)揮治療HCC 作用[13]。分子對接結(jié)果表明,AKT1 蛋白與槲皮素、木犀草素和山奈酚對接的結(jié)合能均小于-9.0 kcal·mol-1,提示 AKT1 蛋白很可能是槲皮素、木犀草素和山奈酚的潛在靶標。目前槲皮素、木犀草素、山奈酚被發(fā)現(xiàn)均可抑制人肝癌細胞中AKT 蛋白的磷酸化激活,誘導(dǎo)細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞的侵襲[14-16]。因此,參桃軟肝丸治療HCC 的機制之一很可能為槲皮素、木犀草素、山奈酚與AKT1蛋白結(jié)合后,抑制了其磷酸化激活,部分阻斷了PI3K/AKT信號通路,從而抑制HCC細胞的增殖。

3.1.2 抑制c-Jun蛋白表達

JUN 是細胞增殖過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,在HCC中可通過拮抗抑癌基因p53 的活性,協(xié)助HCC 細胞逃避細胞凋亡[17]。JUN 蛋白家族包括了 c-Jun、Jun-B 以及Jun-D。體外實驗表明,槲皮素和山奈酚可分別抑制胃癌、前列腺癌細胞[18,19]與肺癌、腎癌細胞[20,21]的c-Jun 蛋白表達而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,抑制其增殖和侵襲。

3.1.3 激活CASP3蛋白

CASP3 是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中位于下游的半胱氨酸蛋白酶,被激活的CASP3 通過裂解和破壞細胞結(jié)構(gòu)以及斷裂DNA 執(zhí)行細胞凋亡過程[22]。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素、木犀草素及山奈酚可通過多種機制激活CASP3蛋白,進而誘導(dǎo)人肝癌細胞的凋亡[8,23,24]。

3.1.4 抑制Myc蛋白表達

Myc 屬核蛋白類的原癌基因,編碼的轉(zhuǎn)錄因子與核DNA 結(jié)合后促進細胞增殖[25],c-Myc 是該家族的重要成員,多數(shù)HCC 存在c-Myc 過表達,其異常激活可促使肝細胞癌的發(fā)展[26]。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素、木犀草素及山奈酚可降低c-Myc 蛋白水平而促進多種腫瘤細胞凋亡[27-28]。此外,槲皮素被報道能與c-Myc 基因啟動子區(qū)域相互作用而形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu),或為潛在的抗腫瘤候選藥物[29]。

3.1.5 調(diào)控miRNA

miRNA 屬于非編碼RNA,可調(diào)節(jié)基因表達。HCC中常有miRNA的失調(diào),miRNA可通過靶向大量關(guān)鍵蛋白的編碼基因,促進HCC 細胞增殖和轉(zhuǎn)移,同時逃避細胞凋亡[30]。木犀草素目前被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控多種miRNA而發(fā)揮抗腫瘤作用[31,32]。

3.2 抑制肝炎病毒基因表達

乙型肝炎、丙型肝炎以及肝硬化是肝癌發(fā)展的主要危險因素[33],其中引起乙型肝炎和丙型肝炎的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)同時也是引起HCC 的重要致癌因素。在全球范圍內(nèi),78%的HCC 歸因于HBV(53%)或HCV(25%)[34]。KEGG 結(jié)果表明,參桃軟肝丸治療HCC 的靶點的通路富集結(jié)果包括了乙型肝炎和丙型肝炎。研究發(fā)現(xiàn),乙型肝炎病毒X 基因(Hepatitis B Virus X gene,HBx)是HBV 上最小的開放讀碼框,可影響HBV 的復(fù)制以及導(dǎo)致肝癌的發(fā)生和發(fā)展[35],參桃軟肝丸在HBV 相關(guān)的HCC 患者中可通過促進HBx 啟動子的甲基化抑制HBx的表達,從而發(fā)揮抑瘤功效[36]。

3.3 抑制腫瘤新生血管生成

在缺氧情況下,HCC 組織中上調(diào)的HIF-1 會誘使VEGF 產(chǎn)生,而VEGF 是促進HCC 新生血管生成的主要因素[37]。研究表明,參桃軟肝丸治療HCC 的作用機制之一是通過抑制肝癌組織VEGF 的表達,減少腫瘤新生血管的生成,延緩腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[4,13]。

綜上,本研究初步表明,參桃軟肝丸具有多成分、多靶點和多通路治療HCC 的作用模式,其潛在機制涉及了抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制肝炎病毒基因表達和抑制腫瘤新生血管生成等方面,目前仍有部分通路和機制尚未得到實驗驗證,但這可為今后闡明參桃軟肝丸治療HCC 的具體機制提供思路,也可為參桃軟肝丸臨床治療HCC提供更多依據(jù)。同時,槲皮素、木犀草素和山奈酚與AKT 蛋白均有較好的親和性,這可為篩選新型治療HCC的靶向藥物提供一定參考。

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