宋曉彤 ，季旭明 ，于華蕓 ，田 升 ，孫美靈 ，趙 月 ，吳智春 ＊＊

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 濟南 250355；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053；3. 山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心 濟南 250355）

小承氣湯出自《傷寒論》：“陽明病，脈遲……若腹大滿不通者，可與小承氣湯，微和胃氣，勿令至大泄下”，由大黃四兩、厚樸二兩、枳實三枚組成，具有輕下熱結(jié)之功效，用于治療陽明腑實證。現(xiàn)代醫(yī)家臨床擴展用于治療手術(shù)后腸梗阻[1,2]和胃腸動力恢復(fù)[3-5]、便秘[6-8]等胃腸動力障礙性疾病，具有較好臨床療效。中醫(yī)經(jīng)典名方具有整體理論、多組分、多靶點、多途徑的特點，對于復(fù)雜疾病的治療提供了廣闊的前景，但本方主要活性成分、靶點仍不清楚，且缺乏整體分析其藥理作用機制的研究。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，系統(tǒng)研究小承氣湯主要藥效成分、作用靶標(biāo)、相關(guān)通路，闡釋“藥物-靶點-通路”之間的相互作用，以期系統(tǒng)、全面闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。

1 材料與方法

1.1 小承氣湯化學(xué)成分收集及篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及中藥綜合 數(shù) 據(jù) 庫（TCMID，http://119.3.41.228: 8000/tcmid/search/），分別以大黃、厚樸、枳實為關(guān)鍵詞，檢索其含有的化學(xué)成分。并依據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）進(jìn)行篩選，閾值分別設(shè)為：OB ＞ 25%，DL ＞ 0.18。

1.2 化學(xué)成分靶點預(yù)測及小承氣湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基 于 SwissTargetPrediction 數(shù) 據(jù) 庫（http://www.swisstargetprediction.ch）以及 STITCH 數(shù)據(jù)庫（http://stitch.embl.de），將可能性設(shè)置為Probability ≥ 0.7，提取上述篩選得到的化學(xué)成分的潛在作用靶點；應(yīng)用Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建小承氣湯中藥材-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

利用 STRING 平臺（https://string-db.org/）將提取的活性成分潛在靶點構(gòu)建靶蛋白群互作網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interaction network，PPI network），應(yīng) 用Cytoscape3.6.1軟件的“Network Analyzer”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，計算網(wǎng)絡(luò)整體的“節(jié)點度值分布（Node Degree Distribution）”和“ 介 數(shù) 中 心 性（Betweenness Centrality）”兩個重要拓?fù)鋮?shù)，以Degree 和 Betweenness 的均數(shù)為“卡值”，選取二者同時在卡值之上的靶點為“關(guān)鍵靶點”。

1.4 小承氣湯關(guān)鍵靶點的基因功能和信號通路分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）對小承氣湯的關(guān)鍵靶點進(jìn)行基因本體論GO（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集，設(shè)置P值＜0.01。

1.5 靶點蛋白分子對接

利用 RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載腫瘤壞死因子α（TNF-α，PDB ID：2AZ5）的3D 結(jié)構(gòu)PDB 格式文件，運用pymol 軟件刪除2AZ5 的水分子及原小分子配體，用AutoDock Tools 1.5.6 添加非極性氫與電荷后保存為pdbqt 格式。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載關(guān)鍵化合物的SDF 格式文件，Chem3D 軟件進(jìn)行能量最小化優(yōu)化后保存為mol2 格式，AutoDock 處理分子環(huán)肽后保存為pdbqt 格式。以TNF-α作為受體，以關(guān)鍵活性成分作為配體，運用AutoDock Vina 1.1.2 進(jìn)行分子對接，設(shè)置Grid box 大小為 6 nm × 6 nm × 6 nm，spacing value 0.375，grid centerx= -14.9、y= 70.0、z= 20.9，GA runs=100，population size=150，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。選擇能量最低的構(gòu)象作為TNF-α與配體的最佳結(jié)合構(gòu)象，保存為 PDB 格式然后用Pymol、DS Visualizer 分析活性成分與TNF-α的結(jié)合位點及氨基酸殘基的相互作用力。

2 結(jié)果

2.1 小承氣湯化學(xué)成分收集與篩選

通過TCMSP 與TCMID 數(shù)據(jù)庫，結(jié)合生物利用度和類藥性進(jìn)行篩選共收集小承氣湯中3 味中藥共201個化學(xué)成分，其中大黃65 個成分，枳實48 個成分，厚樸89個成分，枳實和厚樸2個共有成分。

2.2 化學(xué)成分靶點預(yù)測及小承氣湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫及STITCH 數(shù)據(jù)庫對上述篩選得到的201 個化學(xué)成分進(jìn)行靶點預(yù)測，有62 個成分能找到對應(yīng)潛在靶點248 個，共計得到小承氣湯562 個“成分-靶點”對應(yīng)信息，其中大黃25 個成分，預(yù)測靶點235 個；厚樸13 個成分，預(yù)測靶點86個；枳實24個成分，預(yù)測靶點241個，提示這62個化學(xué)成分為小承氣湯的活性成分。

以大黃、厚樸和枳實三味中藥為中心節(jié)點，內(nèi)圈62 個綠色節(jié)點代表62 個化學(xué)成分，外圈248 個紫色節(jié)點表示潛在靶點，構(gòu)建小承氣湯“中藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），展示了該方多成分、多靶點的作用特征。

2.3 蛋白互作與關(guān)鍵靶點分析

將預(yù)測的小承氣湯潛在靶點蛋白進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)PPI 網(wǎng)絡(luò)有232 個節(jié)點蛋白互作，2519 條相互作用線（圖2）。PPI 網(wǎng)絡(luò)平均度值為21.72，平均介數(shù)為6.17 × 10-3，網(wǎng)絡(luò)度值分布與介數(shù)中心性分布整體情況（圖3、圖4）。度值、介數(shù)均超過平均值的50 個靶蛋白（表1），處于PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵位置，可能是小承氣湯實現(xiàn)藥理效應(yīng)的關(guān)鍵靶點。

2.4 小承氣湯關(guān)鍵靶點的基因功能分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫分析，獲得小承氣湯50 個關(guān)鍵靶點的GO 富集分析結(jié)果27 條。GO 功能注釋分析顯示，涉及神經(jīng)元投射、軸突、膜筏等細(xì)胞成分（cellular component）條目5 條；涉及染色質(zhì)結(jié)合、類固醇結(jié)合、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活子活性等分子功能（molecular function）條目6 條；涉及對肌肉伸展的反應(yīng)、乳腺肺泡的發(fā)育、一氧化氮生物合成過程、RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物過程（biological process）條目16條（圖5）。

圖1 小承氣湯“中藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.5 小承氣湯關(guān)鍵靶點的信號通路分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫分析，獲得關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果63 條（圖6）。其中涉及TNF 信號通路、MAPK 信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt 信號通路、炎癥性腸病、色氨酸代謝、VEGF 信號通路等與胃腸道有關(guān)的信號通路共8條。

2.6 靶點蛋白分子對接分析

當(dāng)配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，能量越低，作用就越強，因此選取小承氣湯的5 個核心成分與TNF-α進(jìn)行分子對接。蘆薈大黃素（aloe-emodin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、兒茶素（(-)-catechin）、木犀草素（luteolin）、厚樸酚（magnolol）與TNF-α的對接結(jié)果良好（表2、圖7）。

3 討論

圖2 小承氣湯潛在靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 度值分布圖

小承氣湯始見于張仲景《傷寒論》，現(xiàn)今被收錄于國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，由大黃、厚樸、枳實3味中藥組成，重用大黃為君以瀉熱通便，厚樸行氣散滿，枳實破氣消痞，諸藥合用功效在蕩熱攻實，主治傷寒陽明腑實證，臨床應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代研究多涉及成分分析、藥理作用和臨床應(yīng)用、歷史沿革等[9]，但物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點和作用機制不清，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點，應(yīng)用TCMSP、TCMID、 SwissTargetPrediciton、 STITCH、 STRING、DAVID 等數(shù)據(jù)庫，分析小承氣湯的有效活性成分及其作用靶點和作用途徑。

圖4 介數(shù)中心性圖

表1 小承氣湯關(guān)鍵靶點的拓?fù)鋮?shù)

圖5 小承氣湯關(guān)鍵靶點GO基因功能分析

陽明腑實證為小承氣湯主證，是指陽明經(jīng)邪熱不解，由經(jīng)入腑，或熱自內(nèi)發(fā)，與腸中糟粕互結(jié)，堵塞腸道所表現(xiàn)出的，以“痞、滿、燥、實”為特點的臨床證候。研究顯示其本質(zhì)為胃腸功能失調(diào)而導(dǎo)致的全身炎癥反 應(yīng) 綜 合 征[10]。 應(yīng) 用 TCMSP、TCMID、STITCH 和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫篩選出64 個有效活性成分，其中大黃25 個成分主要是蒽醌衍生物；厚樸13 個成分，主要是桉樹腦、厚樸酚、和厚樸酚等酚類成分；枳實24個成分，主要為黃酮類成分，如木犀草素、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、異橙黃酮等。研究顯示大黃主要成分游離蒽醌衍生物（大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素和大黃酚等）、厚樸核心成分桉樹腦和厚樸酚、枳實成分川陳皮素和黃酮類（木犀草素、甜橙黃酮）等可通過抑制炎性因子釋放、下調(diào)NF-κB 通路、抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 表達(dá)、抑制NALP3 炎癥復(fù)合體的表達(dá)等多條途徑發(fā)揮抗炎特性[11-20]；此外大黃的核心成分β-谷甾醇具有類糖皮質(zhì)激素抗炎作用[21]，大黃成分結(jié)合蒽醌衍生物番瀉苷B、掌葉二蒽酮、枳實成分新橙皮苷可調(diào)節(jié)胃腸運動[22,23]，發(fā)揮瀉下作用；尤其是桉樹腦和川陳皮素為胰腺炎、結(jié)腸損傷和慢性結(jié)腸炎等胃腸疾病的潛在新藥[16,18]。因此，推測小承氣湯的治療作用主要是上述活性成分通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和胃腸功能實現(xiàn)的。

基于預(yù)測靶點，以STRING 平臺構(gòu)建PPI，依據(jù)拓?fù)鋮?shù)篩選出關(guān)鍵靶點50 個。表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是位于細(xì)胞膜表面的酪氨酸激酶受體，促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并向炎性部位趨化[24-26]，減少白細(xì)胞凋亡，并影響其功能。白細(xì)胞趨化的作用與腸黏膜屏障破壞有關(guān)，并且白細(xì)胞黏附后又會導(dǎo)致結(jié)腸組織破壞，造成惡性循環(huán)[25]。腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）是炎癥趨化因子和激活因子，過量的TNF-α能夠?qū)е录?xì)胞破壞，釋放大量的炎癥介質(zhì)，增強炎癥局部淋巴細(xì)胞浸潤和增殖，加重黏膜炎癥反應(yīng)[27]?；|(zhì)金屬蛋白酶 9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）作用于細(xì)胞外基質(zhì)，通過激活P53 抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而造成結(jié)腸組織損傷[28]。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2，也稱為COX-2）可催化花生四烯酸通過一系列反應(yīng)生成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）[29]。PGE2 是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)分子，可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化或增加相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)起到促炎作用，從而加劇炎癥反應(yīng)[30]。由此推測，小承氣湯通過影響上述相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善胃腸功能。

圖6 KEGG信號通路富集圖

表2 核心成分與TNF-α的結(jié)合能

圖7 小承氣湯部分核心成分與TNF-α分子對接圖

研究還發(fā)現(xiàn)小承氣湯作用關(guān)鍵靶點中存在參與神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)遞質(zhì)受體和神經(jīng)元遷移相關(guān)的MAOA、MAOB、CASP3 和SLC6A4 等，這些基因編碼的蛋白與多種精神性疾病相關(guān)[31-33]，可能是小承氣湯治療陽明腑實證之譫語煩熱的作用靶點。

GO 分析顯示，除涉及細(xì)胞對白介素1 的反應(yīng)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的信號通路以及一氧化氮生物合成過程的正反饋等炎性介質(zhì)代謝相關(guān)的生物過程，還涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程，提示小承氣湯除了調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、改善胃腸功能外，可能與腫瘤信號、細(xì)胞外基質(zhì)代謝等有一定關(guān)系。

KEGG 富集結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點的KEGG 通路包括與腸道疾病相關(guān)的TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、炎癥性腸病、色氨酸代謝、VEGF 信號通路。色氨酸與腸道黏膜的免疫活動密切相關(guān)，是評價炎癥性腸病活動度的炎性標(biāo)志物[34]。炎癥性腸病時可導(dǎo)致色氨酸的消耗以及其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸的積累，色氨酸消耗可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞生長停滯或抑制其分化，而犬尿氨酸積累則可抑制淋巴細(xì)胞分化[35]。在炎癥性腸病中TNF 可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[36]。MAPK在自身免疫和與炎癥相關(guān)的疾病中起著重要作用[37]，MAPKs 需要通過三種細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（p38，ERK1/2，JNK MAPKs）中的任何一種的磷酸化來激活，隨后信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核。研究表明，MAPK 可以調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子（TNF-α和IL-6）的水平并上調(diào)促炎細(xì)胞的表達(dá)[38]。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路是重要的炎癥通路之一，其下游炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)加重疾病的發(fā)展，TLR2 和TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與炎癥性腸病、自身免疫性疾病等多種免疫相關(guān)疾病密切相關(guān)[39]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）與炎性腸病密切相關(guān)，在胃腸道中，HIF-1 調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物，例如血管內(nèi)皮生長因子、腸三葉因子、CD73 在腸道炎癥動物模型起到保護(hù)作用[40]。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是內(nèi)皮細(xì)胞的有效激活劑，并且是炎癥性腸病發(fā)育過程中誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵因素[41]，結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFA 通過上調(diào)CAM并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的黏附而觸發(fā)炎癥。

腸道炎癥以及屏障功能損傷是陽明腑實證的病理基礎(chǔ)[42]，因此推測影響TNF 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、PI3K-Akt信號通路、炎癥性腸病、色氨酸代謝、VEGF 信號通路是小承氣湯調(diào)節(jié)腸道屏障功能，治療陽明腑實證的作用途徑。

此外，根據(jù)小承氣湯關(guān)鍵靶點的KEGG分析，結(jié)果還涉及P53 信號通路、膀胱癌通路、大腸癌通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等癌癥相關(guān)通路，但目前并沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道，這可為經(jīng)方小承氣湯臨床新用、新藥研發(fā)提供一定思路。