羅莎莎，楊麗紅，謝海嘯，金艷慧，劉斯奇，張海月，王明山

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，浙江溫州325015)

遺傳性異常纖維蛋白原血癥(congenitaldysfibrinogenemia,CD)是一種纖維蛋白原基因缺陷致纖維蛋白原分子結構和功能異常的遺傳性疾病，主要與FGA、FGB和FGG3種基因突變有關，多數(shù)為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為常染色體隱性遺傳[1]。該病臨床表現(xiàn)高度異質性,其中約55%患者無臨床表現(xiàn)，25%患者有出血癥狀，20%患者有血栓形成，少數(shù)患者表現(xiàn)為傷口愈合不良、反復流產(chǎn)等[2]。纖維蛋白原(fibrinogen,Fg)對于妊娠期胎囊的植入和胎盤形成至關重要，在妊娠期，F(xiàn)g通過支持細胞和滋養(yǎng)細胞播散，促進母體和胎兒間的血管生成，從而維持胎盤的完整性[3]。因此，遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者在妊娠期最常見的并發(fā)癥為復發(fā)性流產(chǎn)、胎盤早剝、產(chǎn)后出血及血栓形成等[4]。本研究分析了1例遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的臨床表型和基因型，并深入探討突變基因與胎停育之間的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 先證者，女，33歲，漢族，7年前生育1男孩?，F(xiàn)懷孕6周+5 d，此前3年內有不明原因胎停育2次，第一次孕5周+6 d，第二次孕+3 d，2018年2月至我院門診要求進行相關檢查。凝血常規(guī)檢查示凝血酶時間(thrombin time，TT)明顯延長(34.4 s/17.0 s)，F(xiàn)g活性(Fg activity，F(xiàn)g:C)顯著降低(1.02 g/L)，血小板計數(shù)及肝腎功能指標正常?；颊咦允黾韧陆?jīng)規(guī)律，無其他明顯自發(fā)出血癥狀，無血栓史，無肝腎功能異常史。否認父母近親婚配及其家系成員出血史。采集先證者及其家系3代共6名成員的外周血標本。

1.2主要儀器與試劑 STA-R全自動血凝儀及原裝配套試劑(法國Stago公司);LX20PRO 全自動生化分析儀(美國Beckman公司);2720型PCR擴增儀(美國ABI公司);凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng) (上海天能公司);Fg抗原(Fg antigen，F(xiàn)g:Ag)檢測試劑盒(浙江伊利康生物公司)；DNA提取試劑盒(上海荻碩貝肯生物公司)；PCR擴增試劑盒(美國Promega公司)。

1.3標本采集與處理 采集受試者治療前外周靜脈血2.7 mL，用0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝；3 000 r/min離心15 min，上層乏血小板血漿用于各凝血指標及Fg:Ag含量的檢測，2 h內檢測完畢。下層血細胞用于提取基因組DNA及PCR擴增測序，置于-40 ℃保存。

1.4實驗室表型指標檢測 采用凝固法，按照STA-R全自動血凝儀及原裝配套試劑說明書檢測血漿凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、TT、Fg:C；采用免疫比濁法檢測D二聚體(D-Dimer,D-D)和纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin degradation products，F(xiàn)DPs);采用免疫比濁法，按照LX20PRO全自動生化分析儀及Fg抗原(Fg antigen，F(xiàn)g:Ag)檢測試劑盒說明書檢測Fg:Ag含量。均按照試劑盒說明書進行結果判讀。

1.5全血基因組DNA提取 采用高鹽法，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取先證者及其家系成員的外周血基因組DNA，用DU800核酸蛋白分析儀檢測基因組DNA產(chǎn)物的純度和濃度，取純度(A260/280 nm約1.9)和濃度為50 ng/μL的DNA產(chǎn)物，置-40 ℃保存。

1.6纖維蛋白原基因檢測 根據(jù)FGA、FGB、FGG基因在GenBank中的參考序列號(分別為M64982、M64983和M10014)，利用Primer Primer 6.0TM軟件結合參考文獻[5]設計覆蓋Fg基因所有外顯子及其側翼序列的引物，引物由上海桑尼公司合成，引物序列見表1。PCR反應體系為50 μL，包括Taq PCR MasterMix(含染料)25 μL，雙蒸水18 μL,DNA模板3 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s,55 ℃或56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外光下觀察為單一明亮條帶。送上海桑尼生物公司(測序儀為ABI PRISM 3730)進行正、反向測序。測序結果用Chromas和DNAMAN軟件進行分析，并與NCBI中公布的FGA、FGB、FGG基因在GenBank中的參考序列進行比對，尋找基因突變位點，發(fā)現(xiàn)突變基因后，通過反向測序進行驗證。明確先證者基因突變位點后，再擴增家系其他成員的相應區(qū)域并進行測序分析。

2 結果

2.1先證者及家系成員血漿實驗室表型指標檢測結果 先證者血漿PT、APTT、D-D和FDPs檢測結果正常，TT顯著延長為34.4 s/17.0 s，F(xiàn)g:C降低至1.02 g/L，F(xiàn)g:Ag在參考范圍內(2.0～4.0 g/L)。先證者母親、弟弟及兒子的檢測結果與先證者相似。先證者父親和丈夫的所有上述檢測結果均在參考范圍內。見表2。

表1 FGA、FGB、FGG基因的引物序列及擴增片段長度

表2 先證者及家系成員的臨床表型檢測結果

2.2基因檢測結果FGA、FGB和FGG基因外顯子和側翼序列測序結果顯示，先證者FGG基因第8外顯子存在g.7476G>A雜合錯義突變，導致第275位的精氨酸(Arg)被組氨酸(His)取代(p.γArg275His)；FGB基因第8外顯子存在g.7652G>A雜合多態(tài)性，導致第478位的精氨酸(Arg)被賴氨酸(Lys)取代(p.BβArg478Lys)。家系成員中，先證者的母親、弟弟和兒子均存在g.7476G>A雜合錯義突變，先證者的父親為g.7652G>A雜合多態(tài)性。見圖1、2。

注：，先證者；，Arg478Lys多態(tài)性;,Arg275His雜合突變；，Arg275His雜合突變和Arg478Lys多態(tài)性。

圖1 遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系圖

注：A，F(xiàn)GG基因第8外顯子g.7476G>A雜合錯義突變；B，F(xiàn)GG基因第8外顯子野生型；C，F(xiàn)GB基因第8外顯子g.7652G>A雜合多態(tài)性；D，F(xiàn)GB基因第8外顯子野生型。

圖2 該先證者Fg基因測序結果

3 討論

Fg由簇集于4q31染色體約50 000 bp內的3 個獨立基因(FGA、FGB、FGG)所編碼的3條肽鏈 (Aα、Bβ、γ)組成的六聚體，相對分子質量約為340 000，是血漿中含量最高的凝血因子。Fg主要在肝細胞中合成，少部分在上皮細胞中合成，其主要生理功能為進入血液循環(huán)后參與凝血和調節(jié)纖溶，因此Fg異常往往導致各種出凝血疾病。遺傳性纖維蛋白原異常患者在妊娠期最常見的并發(fā)癥為反復自然流產(chǎn)、胎盤早剝等。Frenkel等[6]曾報道2例遺傳性低纖維蛋白原血癥孕婦在分娩時均發(fā)生胎盤早剝。本研究發(fā)現(xiàn)先證者FGG基因第8號外顯子存在p.γArg275His雜合錯義突變和p.BβArg 478 Lys雜合多態(tài)性。γArg275位于D-D接觸面，D-D結合是形成纖維蛋白網(wǎng)架結構所必須。γ鏈275Arg被His替換，會引起D-D連接區(qū)域結構的改變，進而影響纖維蛋白單體聚合，導致異常纖維蛋白原血癥。Arg478Lys是纖維蛋白原FGB基因較常見的多態(tài)性之一，BβArg478Lys位置靠近以下區(qū)域：預測的β鏈聚合點，β鏈的鈣離子結合部位以及β鏈和α鏈羧基端結合部位，這3個區(qū)域是纖維蛋白原聚集的重要部位。

蔣麗婭等[7]對1例遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者的FGG基因突變分析發(fā)現(xiàn)，p.γArg275His錯義突變是導致異常纖維蛋白原血癥的主要原因。此外，在已報道的γArg275His病例中約27%患者有血栓形成，該突變將導致纖維蛋白肽釋放，纖維蛋白單體聚合，纖維蛋白交聯(lián)或纖維蛋白溶解的改變，可引起出血或血栓形成性疾病。Ajjan等[8]對p.BβArg 478Lys多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，Lys478的纖維蛋白溶解率明顯低于Arg 478，提示Lys 478纖維蛋白具有纖維薄、孔小的特點，表現(xiàn)出較強的硬度，對纖溶功能有較強的抵抗力，形成的纖維蛋白不容易降解，增加血栓形成的風險。本研究中的先證者同時存在p.γArg275His雜合錯義突變和p.BβArg478Lys雜合多態(tài)性，其所發(fā)生的胎停育現(xiàn)象推測與p.γArg275His雜合錯義突變和p.BβArg478Lys雜合多態(tài)性有關。

研究顯示，纖維蛋白原FGG基因敲除小鼠妊娠不能維持至足月[9]，表明纖維蛋白原對妊娠的重要性。妊娠期間纖維蛋白凝塊結構改變均會造成不良妊娠[10]。受精卵著床后子宮螺旋動脈開始不斷被滋養(yǎng)細胞侵蝕，導致管腔擴大，為滿足妊娠時期的血氧供應，子宮動脈血流阻力進行性降低[11-12]。在早孕時期，若子宮動脈血流灌注不足，即可能導致自然流產(chǎn)、胎兒生長受限、胎盤早剝、子癇前期、胚胎停育等不良妊娠結局[13]，如果子宮動脈血流灌注在早期能夠得到糾正，妊娠結局就會顯著改善。因此，母體中纖維蛋白原含量和功能是否正常對妊娠至關重要。該先證者Fg:Ag含量正常，但Fg:C降低，為Ⅱ型Fg缺陷癥患者，即異常纖維蛋白原血癥。由于Fg結構發(fā)生了改變，妊娠導致生理性高凝狀態(tài)所產(chǎn)生的纖維蛋白不易被纖溶酶溶解，子宮螺旋動脈血流阻力進行性升高，供應胎兒的血流減少，氧氣和營養(yǎng)物質無法滿足胎兒生長發(fā)育的需要，從而可能導致胎停。

綜上所述，本研究分析了p.γArg275His雜合錯義突變和p.BβArg478Lys雜合多態(tài)性導致該先證者胎停育的可能機制。對于臨床上出現(xiàn)胎停育的婦女進行易栓癥的篩查和基因突變分析，查找原因，對癥治療，是預防再次出現(xiàn)胎停育的有效措施。但由于這只是1個家系先證者的臨床表現(xiàn)，還有待于分析更多的病例以期為臨床提供依據(jù)。