鄧文松,馬巧玲,張曉云,吳志華,洪麗梅
(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第908醫(yī)院檢驗科,江西鷹潭 335000;2.鷹潭市中心血站,江西鷹潭335000)
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,且治療后的復(fù)發(fā)率較高,給臨床診治及患者預(yù)后帶來較大的不利影響。微小RNA(microRNA,miR)是近年來受到廣泛關(guān)注的非編碼小分子RNA,在體內(nèi)參與多種生物學(xué)行為的調(diào)控,并被證實與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。miR-181a是一種具有促癌特性的微小RNA,研究證實,miR-181a在MM患者骨髓組織中呈顯著高表達趨勢[1-2],提示miR-181a可能參與骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展。另有多項研究證實,在胃癌及骨肉瘤細胞中,miR-181a的促癌活性與靶向抑制抑癌基因Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(ras association domain family 1,RASSF1A)的表達密切相關(guān)[3-4],但miR-181a是否在MM患者骨髓中靶向RASSF1A并調(diào)控相應(yīng)的惡性生物學(xué)行為目前尚未明確。為探討miR-181a對多發(fā)性骨髓瘤惡性生物學(xué)特征的調(diào)節(jié)作用及可能的作用機制,本研究擬檢測骨髓瘤組織及正常骨髓組織中miR-181a表達的差異,并以多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266為研究對象分析miR-181a靶向RASSF1A促進U266細胞增殖、侵襲的作用。
1.1研究對象 收集2014年2月至2018年12月在我院行骨髓穿刺并經(jīng)病理組織學(xué)診斷為MM患者40例,男23例,女17例,年齡(48.6±8.1)歲;納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];(2)臨床及病理資料完整;(3)未接受過MM相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有惡性腫瘤病史;(2)合并其他血液系統(tǒng)疾?。?3)合并自身免疫性疾病、肝腎功能不全等。采集同期在我院接受骨髓穿刺并經(jīng)病理組織學(xué)證實為正常骨髓的受試者50例,男29例、女21例,年齡(47.2±9.2)歲,均排除合并嚴重肝腎功異常、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等其他系統(tǒng)疾病。各研究對象均知情同意,本研究經(jīng)中國人民解放軍第一八四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:XHEC-D-2018076)。MM患者與正常骨髓象受試者的性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
1.2主要試劑與儀器 U266細胞系購自中科院上海細胞資源中心;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國Gibco公司);MTS細胞活力檢測試劑盒、野生型及突變型RASSF1A3′UTR的熒光素酶報告及相應(yīng)的熒光素酶曝光基因檢測試劑盒(美國Promega公司);Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司);結(jié)晶紫(美國Sigma公司);miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA實時熒光定量PCR檢測試劑盒(北京天根公司);RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京索萊寶公司);兔抗人RASSF1A、cyclinD1、RhoA多克隆抗體(美國Abcam公司);驢抗兔辣根過氧化物酶IgG二抗(北京奧維亞生物技術(shù)公司)。Bx53正置顯微鏡(日本Olmpus公司);Elx800酶聯(lián)儀(美國Bio-Tek公司);Multiskan Sky分光光度計(美國Thermo公司);CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);Tanon-4100化學(xué)顯影儀(上海天能公司);DR1900分光光度計(美國哈希公司);GloMax 2020單管型發(fā)光檢測儀(北京原平皓生物公司)。
1.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的U266細胞,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),待細胞融合度達90%時,用12.5 g/L胰蛋白酶消化傳代并繼續(xù)培養(yǎng),取傳代后處于對數(shù)生長期的細胞進行分組處理。實驗設(shè)為NC mimic組、miR-181a mimic組、NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組,按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書將NC mimic(2 μL/mL)、miR-181a mimic、NC inhibitor(20 pmol/mL)、miR-181a inhibitor(20 pmol/mL)分別轉(zhuǎn)染進入各組細胞,連續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。每個樣本設(shè)5個復(fù)孔。
1.4實時熒光定量PCR檢測miR-181a表達量
1.4.1RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取MM患者骨髓組織及正常骨髓組織各約20~30 mg,另取轉(zhuǎn)染后的各組U266細胞1×106個,按照miRNA提取試劑盒說明書分離組織或細胞中的miRNA,采用DR1900分光光度計檢測吸光度(A260/280 nm)在1.7~2.0的樣本用于后續(xù)實驗。取2 μg miRNA并按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,樣本置于-20 ℃保存。
1.4.2引物設(shè)計及實時熒光定量PCR 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物,并送上海生工公司合成。miR-181a的正向引物序列:5′-TAGCTAGCTAGTCAGTGTC′-3′;β-actin正向引物序列:5′-TCGATCGATGCTAGCTAT′-3′,反向引物序列:5′-TAGCATAGCTAGCTAGCT-3′,退火溫度58 ℃、產(chǎn)物164 bp;按照miRNA實時熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進行檢測,PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括cDNA 2 μL,10 μmol/L正向引物0.4 μL,通用反向引物0.4 μL,PCR Mix 10 μL,去離子水7.2 μL。循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 34 s,共40個循環(huán),在60 ℃時采用CFX96實時熒光定量PCR儀配套軟件iQ5 V2.1.97進行熒光采集及熔解曲線分析,根據(jù)循環(huán)閾值(Ct),以β-actin為內(nèi)參照。按照2-ΔΔCt法計算miR-181a的表達量。
1.5MTS法檢測細胞增殖活力 取經(jīng)12.5 g/L胰蛋白酶消化后的各組U266細胞,用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度至1×106/mL,取200 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),按照1.3的方法分組并轉(zhuǎn)染24 h后,按照MTS細胞活力檢測試劑盒說明書操作進行細胞增殖活力檢測,用Elx800酶聯(lián)儀測定450 nm波長處的吸光度(A450 nm)值。
1.6Transwell試驗檢測細胞侵襲能力 取經(jīng)12.5 g/L胰蛋白酶消化后的U266細胞,用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸,調(diào)節(jié)細胞密度至1×106mL,取200 μL細胞懸液接種于預(yù)涂基質(zhì)膠的Transwell上層小室,下層小室加入800 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基,按照1.3的方法分組并轉(zhuǎn)染24 h后,取出小室,PBS漂洗2次后用棉簽擦去未穿膜細胞,經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后結(jié)晶紫染色10 min,在光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細胞的數(shù)目。
1.7熒光素酶報告基因的檢測 取經(jīng)12.5 g/L胰蛋白酶消化后的U266細胞,調(diào)節(jié)細胞密度至1×106/mL,取500 μL接種于24孔細胞培養(yǎng)板,先將野生型及突變型的RASSF1A熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染進入細胞,使報告基因的終濃度達1 μg/mL,按照1.3轉(zhuǎn)染步驟操作,轉(zhuǎn)染24 h后用2.5 g/L胰蛋白酶消化并以3 000 r/min離心10 min,收集細胞,按照熒光素酶報告基因檢測試劑盒及GloMax 2020單管型發(fā)光檢測儀檢測螢火蟲熒光值和海腎熒光值。熒光素酶報告基因的熒光活性計算公式:螢火蟲熒光值/海腎熒光值。
1.8蛋白質(zhì)提取及western blot
1.8.1蛋白質(zhì)提取 組織蛋白質(zhì)提?。喝M患者骨髓組織及正常骨髓組織20 mg,加入RIPA裂解液0.5 mL后進行超聲勻漿處理;細胞蛋白質(zhì)提?。喝?×106個U266細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板,按照1.3的方法分組處理后,加入RIPA裂解液0.1 mL后用細胞刮刀裂解細胞。取裂解液,按照BCA試劑盒說明書操作測定總蛋白質(zhì)含量,然后加入1/4體積的5×SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液,100 ℃加熱變性10 min,分裝并置-80 ℃保存。
1.8.2western blot 配制10% SDS-PAGE分離膠,將上述蛋白質(zhì)樣品按30 μg總蛋白質(zhì)的量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓,分離膠采用100 V電壓),電泳結(jié)束后在350 mA恒流條件下2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于50 g/L脫脂牛奶中室溫封閉NC膜2 h,加入兔抗人RASSF1A、cyclinD1、RhoA多克隆抗體(1∶1 000稀釋)在4 ℃溫育過夜,加入 TBS/T在水平搖床上洗膜3次,每次5 min;加入驢抗兔辣根過氧化物酶IgG二抗(1∶2 000稀釋)溫育2 h,加入TBS/T在水平搖床上洗膜5次后,在Tanon-4100化學(xué)顯影儀掃描并曝光得到蛋白質(zhì)條帶,公式:目標(biāo)蛋白質(zhì)灰度值/β-actin灰度值。
2.1各組miR-181a及RASSF1A、cyclinD1、RhoA表達的比較 實時熒光定量PCR結(jié)果表明,MM患者骨髓組織中miR-181a的表達水平為1.31±0.28,明顯高于正常骨髓組織(0.67±0.09)(P<0.05);western blot結(jié)果表明,cyclinD1、RhoA蛋白的表達量明顯高于正常骨髓組織,而RASSF1A蛋白的表達量明顯低于正常骨髓組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1、表1。經(jīng)Pearson檢驗,MM骨髓組織中miR-181a的表達量與RASSF1A的表達量呈負相關(guān)(r=-0.351,P<0.05),而與cyclinD1、RhoA的表達量呈正相關(guān)(r分別為0.318,0.408,P<0.05)。
注:1~5為正常骨髓組織,6~10為MM骨髓組織。
表1 MM骨髓與正常骨髓中miR-181a及RASSF1A、cyclinD1、RhoA表達的比較
參數(shù)MM骨髓(n=40)正常骨髓(n=50)tPmiR-181a1.31±0.280.67±0.0913.880<0.001RASSF1A0.85±0.191.44±0.3111.108<0.001cyclinD10.65±0.130.34±0.0812.779<0.001RhoA0.95±0.210.60±0.149.049<0.001
2.2轉(zhuǎn)染后U266細胞miR-181a的表達量 實時熒光定量PCR結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染24 h后,NC mimic組、miR-181a mimic組U266細胞中miR-181a的表達量分別為0.61±0.09和12.66±2.23,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.798,P<0.001)。而NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組U266細胞中miR-181a的表達量分別為0.56±0.08和0.31±0.06,兩組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.590,P<0.001)。
2.3轉(zhuǎn)染后各組U266細胞的增殖活力 MTS法檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后24 h,NC mimic組、miR-181a mimic組U266細胞的A450 nm值分別為0.51±0.07和0.86±0.17,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.257,P<0.05);NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組U266細胞的A450 nm值分別為0.55±0.08和0.32±0.07,兩組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.838,P<0.05)。
2.4轉(zhuǎn)染后各組U266細胞的侵襲數(shù)目 Transwell試驗檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后24 h,NC mimic組、miR-181a mimic組U266細胞的侵襲數(shù)目分別為(10.29±2.12)個、(38.59±7.41)個,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.210,P<0.05);而NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組U266細胞的侵襲數(shù)目分別為(11.41±2.76)個、(7.28±1.24)個,兩組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.052,P<0.05)。見圖2。
2.5miR-181a對RASSF1A及下游增殖、侵襲基因的調(diào)節(jié)作用 western blot結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染24 h后,miR-181a mimic組U266細胞中RASSF1A蛋白表達量明顯低于NC mimic組(t=5.438,P<0.05),而cyclinD1、RhoA蛋白表達量明顯高于NC mimic組(t分別為3.917,3.654,P<0.05);此外,miR-181a inhibitor組U266細胞中RASSF1A蛋白的表達量明顯高于NC inhibitor組(t=3.464,P<0.05),cyclinD1、RhoA蛋白表達量明顯低于NC inhibitor組(t分別為6.277,9.295,P<0.05)。見圖3、表2。
圖3 轉(zhuǎn)染mimic(A)、inhibitor(B)后U266細胞中RASSF1A、cyclinD1、RhoA蛋白的表達
蛋白質(zhì)NCmimicmiR-181amimicNCinhibitormiR-181ainhibitorRASSF1A1.54±0.260.81±0.151.25±0.211.83±0.31cyclinD10.55±0.070.84±0.150.71±0.120.32±0.07RhoA0.62±0.120.97±0.170.66±0.100.39±0.06
2.6miR-181a靶向RASSF1A3′UTR的驗證 雙熒光素酶報告基因檢測表明,miR-181a mimic組野生型RASSF1A3′UTR熒光素酶報告基因的熒光活性值分別為0.291±0.062和0.173±0.035,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.315,P<0.05);而NC mimic組、miR-181a mimic組突變型RASSF1A3′UTR分別為0.289±0.051和0.295±0.042,兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.182,P>0.05)。此外,miR-181a inhibitor組野生型RASSF1A3′UTR熒光素酶報告基因的熒光活性值分別為0.273±0.057和0.399±0.067,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.203,P<0.05);而NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組突變型RASSF1A3′UTR分別為0.280±0.055和0.291±0.067,兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.284,P>0.05)。
近年來,miR-181a在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到越來越多關(guān)注。多項研究[6-8]證實,肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等惡性腫瘤病灶內(nèi)miR-181a的表達均升高。劉仁濤等[2]研究報道,miR-181a在MM骨髓組織中的表達水平(112.68±16.53)明顯高于正常對照組(75.94±10.02),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在本實驗中,miR-181a在MM骨髓組織中的表達水平為1.31±0.28,亦明顯高于正常骨髓組織(0.67±0.09),與劉仁濤等[2]的報道結(jié)果較為一致。結(jié)合已知的miR-181a靶向抑制多種抑癌基因并促進腫瘤細胞增殖、侵襲的效應(yīng)分析報道[3-4],我們推測骨髓中高表達的miR-181a可能通過促進MM細胞的增殖、侵襲參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。
本研究進一步在離體細胞中驗證了miR-181a對MM細胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用。Sun等[9]研究證實,miR-181a靶向SRC激酶信號抑制劑(SRCIN1)促進結(jié)直腸癌細胞的血管新生。Le等[10]研究證實,miR-181a靶向視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1(RB1)促進甲狀腺癌細胞的生長。本實驗中,轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后U266細胞中miR-181a的表達水平明顯增加,而轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后細胞中miR-181a的表達水平明顯減少。在轉(zhuǎn)染后對細胞增殖和侵襲的觀察結(jié)果顯示,miR-181a mimic能夠促進MM細胞的增殖和侵襲,miR-181a inhibitor能夠抑制MM細胞的增殖和侵襲,表明miR-181a參與MM增殖和侵襲的調(diào)控。
miR-181a已經(jīng)被證實能夠靶向RASSF1A基因mRNA的3′UTR,抑制RASSF1A基因的表達[3-4]。RASSF1A作為重要的抑癌基因,能夠通過抑制下游cyclinD1的表達以抑制細胞增殖,并抑制下游RhoA的表達以抑制細胞侵襲;當(dāng)RASSF1A基因的表達被miR-181a抑制時,相應(yīng)的抑癌作用也被削弱,進而參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[11-12]。在MM骨髓中,RASSF1A基因已經(jīng)被證實呈顯著低表達的趨勢[2]。在本研究中,MM骨髓中RASSF1A的表達明顯減少,而下游cyclinD1、RhoA的表達明顯增多,表明RASSF1A介導(dǎo)的抑癌作用在MM中受到抑制。本實驗還在U266細胞中觀察到miR-181a mimic能夠減少RASSF1A的表達,增加cyclinD1及RhoA的表達,miR-181a inhibitor能夠增加RASSF1A的表達,減少cyclinD1及RhoA的表達,并且miR-181a mimic能夠使RASSF1A3′UTR熒光素酶報告基因的熒光活性降低。以上結(jié)果表明miR-181a能夠在MM中靶向抑制RASSF1A的表達,進而使下游cyclinD1及RhoA表達增加并促進細胞的增殖和侵襲。
綜上所述,miR-181a能夠促進MM細胞的增殖、侵襲并靶向抑制RASSF1A的表達;本研究存在以下不足之處:首先,收集的臨床樣本數(shù)量較少,今后需進一步擴大樣本量,明確miR-181a在MM骨髓中的表達,并隨訪其與病情轉(zhuǎn)歸、預(yù)后的相關(guān)性;其次,雖然通過離體細胞證實了miR-181a促進MM細胞增殖和侵襲的作用,但缺乏活體實驗數(shù)據(jù),今后仍需進行動物實驗及人體實驗,以驗證miR-181a在MM發(fā)生、發(fā)展中的作用。