宋御繁，王娜娜，張婷，陳英劍，胡成進

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院檢驗科，濟南 250031；2.山東第一醫(yī)科大學&山東省醫(yī)學科學院公共衛(wèi)生學院，山東泰安 271016)

肺癌是全球范圍內癌癥死亡的主要原因之一[1]。肺癌患者中約85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[2]。手術是早期NSCLC患者首選的治療手段，但由于發(fā)病隱匿，約75%的患者就診時已為晚期或出現(xiàn)局部轉移[3]，喪失最佳手術治療時機。鉑類雙聯(lián)的化療方式可延長患者生存期，但晚期NSCLC患者預后極差，5年生存率低于17%[4]。隨著基因分析與分子診斷技術的不斷發(fā)展，越來越多的基因突變體成為癌癥靶向治療和預后評估的重要標志物，基于基因組變化的個體化治療比傳統(tǒng)治療手段更有針對性[5]。迅速發(fā)展的基因檢測技術讓有限的腫瘤樣本能夠獲得更廣泛的分子分析，促使NSCLC患者個體化治療的實施，基因突變篩查對提高NSCLC患者生存率、改善患者生活質量具有重要意義[6]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術具有高通量、高靈敏度、高特異性及操作簡便等特點，廣泛應用于腫瘤分子研究，是對已知突變基因分型的有力方法[7]。

1 MALDI-TOF MS技術基本原理及特點

MALDI-TOF MS是一種新型軟電離生物質譜分析技術，目前該技術可應用于基因突變檢測、基因多態(tài)性研究、微生物鑒定、腫瘤生物學標志物檢測以及篩查、微小殘留病變預后風險評估、藥物研發(fā)及監(jiān)測等方面。其基本原理是將樣品分散在基質分子中形成晶體，當用激光照射晶體時，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，樣品解吸附使生物分子電離，離子在電場作用下加速飛過真空飛行管道，通過飛行時間(TOF)質量分析器進行質譜分析。在固定的動能下，質量小的離子“飛行”速度較快，可先到達檢測器，質量大的離子“飛行”速度較慢，到達檢測器的時間長，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同來測定離子的質荷比(m/z)，進一步確定分子量。最終通過相關專用軟件分析，繪制出特異性指紋圖譜。

相較于其他質譜技術，MALDI-TOF MS有其獨特的優(yōu)點：(1)靈敏度高，可為亞微克級樣本提供信息；(2)準確度高，測量相對分子質量(Mr)為1 000～3 000 Da的分子時，準確度可達99.9%[8]；(3)可識別并量化與特定基因突變相關的疾病或病理狀況[9]；(4)兼容性強，可與其他質譜技術相結合，如液相色譜技術、雙向電泳及磁珠技術等[10]；(5)可檢測血清、血漿、尿液、支氣管洗脫液、腦脊液、細胞裂解液等各種分泌物，并可直接分析組織切片；(6)高通量檢測，速度快；(7)無標記檢測，成本消耗低。MALDI-TOF MS的高特異性和準確性使其有可能克服其他生物化學技術和免疫分析局限性[11-12]，準確反映被測樣本中的分子情況，為臨床實驗室的常規(guī)檢測和患者個體化治療提供了新的策略，對臨床實踐十分有吸引力。

2 MALDI-TOF MS檢測非小細胞肺癌常見基因突變

從根本上說，癌癥是由基因變異或表觀遺傳改變引起的遺傳性疾病。然而，由于腫瘤異質性，即使是相同病理類型的腫瘤患者對治療反應也可能不同[13]，因此，癌癥基因組學中的分子診斷對于制定針對性治療決策必不可少。NSCLC是實體惡性腫瘤在精準醫(yī)學個體化治療方面的代表性實例[14]。在NSCLC中，相當高比例的患者呈現(xiàn)廣泛的基因組不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性發(fā)生在不同水平時，可成為腫瘤發(fā)生的主要驅動力[15-16]。其中，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)和鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)等是NSCLC重要的驅動基因，在非小細胞肺癌靶向治療中起著重要作用[17-18]。目前可通過不同的分子方法來檢測非小細胞肺癌基因突變，如Sanger測序、擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)[19]、實時熒光定量PCR、焦磷酸測序、新一代測序(NGS)和MALDI-TOF MS技術等，各自具體的特點見表1。其中Sanger測序作為基因檢測金標準，在檢測基因突變時對至少20%的等位基因突變敏感性較低[20]。其他方法靈敏度較高，但大多受限于樣本質量，對樣本腫瘤細胞含量有較高要求。而MALDI-TOF質譜系統(tǒng)是一種有效的體細胞突變分析方法，能夠在有限的腫瘤組織樣本中實現(xiàn)分子譜分析，對DNA質量要求低，能夠進行多重基因檢測及突變頻率的定量，同時可以將高靈敏度和高特異性的優(yōu)勢與簡便的樣本處理相結合，顯示出作為臨床分子診斷工具的極大潛力。

表1 各種基因突變檢測方法特點比較

2.1MALDI-TOF MS檢測EGFR基因突變EGFR基因突變作為NSCLC發(fā)現(xiàn)的第一個治療靶點，是目前研究最深入、最成功的治療靶點。最新研究表明，EGFR是亞太地區(qū)和俄羅斯地區(qū)NSCLC中最常見的驅動基因，發(fā)生率為49.3%[29]。EGFR基因突變主要發(fā)生在18、19、20和21號外顯子上，其中21號外顯子p.L858R位點突變和19號外顯子p.E746_A750del缺失突變約占90%[30]。研究證實，EGFR基因突變是NSCLC患者選擇接受EGFR-TKIs的治療依據(jù)，21號外顯子L858R位點突變及19號外顯子缺失患者對EGFR-TKIs治療反應良好，而20號外顯子T790M點突變患者對EGFR-TKIs存在耐藥性[31]。NSCLCEGFR突變檢測已成為臨床常規(guī)檢測項目之一，對改善患者預后及個體化治療具有重要意義。Min等[32]使用3種不同方法檢測107例NSCLC患者經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織樣本EGFR突變狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)MassARRAY MALDI-TOF MS技術、焦磷酸測序和肽核酸鉗制法(PNAc)的EGFR突變檢出率分別為56.1%、48.6%和45.8%。MALDI-TOF MS技術靈敏度為85.7%，明顯高于焦磷酸測序和肽核酸鉗制法(PNAc)的74.3%和70%，對NSCLC患者中是否存在EGFR突變具有較強的鑒別能力。Shepherd等[33]將經(jīng)過RT-PCREGFR突變檢測的532例NSCLC患者腫瘤DNA通過MassArray MALDI-TOF MS技術重復檢測，結果顯示，兩種方法檢測樣本EGFR突變的總體符合率為93.2%，其中14例患者通過MassArray MALDI-TOF MS檢測到EGFR突變陽性，均為常見的19、20、21號外顯子突變，而RT-PCR方法未檢測到EGFR基因突變。Giannini等[34]通過傳統(tǒng)的Sanger測序和MALDI-TOF MS技術平行評估2 387例NSCLC患者EGFR突變率，結果顯示，Sanger測序檢測DNA含量低或受損的樣本的靈敏度較低，與之相比，MALDI-TOF MS檢測樣本突變成功率則明顯升高。采用多靶基因檢測技術檢測后，MALDI-TOF MS檢測EGFRL858R突變的檢出率提高了約1倍。Su等[35]采用類似方法對45例NSCLC患者FFPE組織樣本進行EGFR突變檢測，結果發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS和Sanger測序結果一致，具有100%的分析靈敏度和特異性，其失敗率低至0.1%，且MALDI-TOF MS分析平均周轉時間(TAT)為3 d，能夠有效縮短整體治療決策時間，適用于臨床管理。

2.2MALDI-TOF MS檢測ALK基因突變 間變性淋巴瘤激酶(ALK)融合是NSCLC獨特的分子亞群，約3%～7%的NSCLC具有ALK染色體重排，是繼EGFR基因之后發(fā)現(xiàn)的又一重要驅動基因。最常見的融合基因是棘皮動物微管相關蛋白樣4(echinodermmicro tubule associated proteinlike 4,EML4)[36]。EML4與ALK均位于2號染色體短臂上，兩基因通過逆位融合形成1個新的EML4-ALK基因。一項PROFILE系列的臨床研究證實[37]，EML4-ALK融合患者對酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼的反應率和疾病控制時間均明顯好于化療。ALK融合陽性患者對克唑替尼的反應率可達60%～80%，而對化療藥物的反應率僅為30%～40%?！吨袊砥どL因子受體基因突變和間變淋巴瘤激酶融合基因陽性非小細胞肺癌診斷治療指南》建議：病理診斷為NSCLC中肺腺癌或含有腺癌成分的患者均應進行ALK融合基因檢測[38]。Sakai等[39]使用MassARRAY iPLEX MALDI-TOF MS分析NSCLC患者的FFPE樣本，檢測到EML4-ALK變體1的清晰質量峰，并通過PCR產(chǎn)物亞克隆和測序證實了每個樣本陽性結果的準確性。MALDI-TOF MS技術能夠以高靈敏度檢測9種不同的EML4-ALK變異類型。目前免疫熒光原位雜交(FISH)是臨床ALK融合基因檢測的標準方法，但其不能區(qū)分ALK基因變異的類型，且操作復雜，價格昂貴。與FISH相比，MALDI-TOF MS分析能夠在少量NSCLC FFPE組織中區(qū)分不同的EML4-ALK變體，是檢測EML4-ALK變異類型的有力工具。

2.3MALDI-TOF MS檢測KRAS基因突變KRAS基因突變是NSCLC中重要的新興標志物，在全球肺癌驅動基因分布中，KRAS突變排例位居前列。最常見的是2號外顯子第12或13位發(fā)生突變，約占KRAS突變類型的85%～90%。Sherwood等[40]使用基于MassARRAY iPLEX MALDI-TOF MS技術分析238個非小細胞肺癌患者FFPE腫瘤樣本，并將結果與ARMS-PCR檢測到的數(shù)據(jù)進行比較，兩種方法檢測樣本KRAS突變率的總體一致性百分比為99.1%，此外，MALDI-TOF MS技術還檢測到19%存在KRAS突變的患者同時伴有其他突變，并證實其中最常見的是腫瘤抑制基因TP53、PIK3CA和CDNK2A。Giannini等[41]通過檢測NSCLC患者的KRAS突變，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS和焦磷酸測序檢測KRAS突變率分別為31.7%和28.7%，且在手術樣本、小組織活檢、細胞學樣本中，MALDI-TOF MS技術檢測的KRAS突變率分別為37.9%、31.7%和32.7%，而焦磷酸測序檢測的突變率分別為34.2%、28.8%和29.0%，由此看出，MALDI-TOF MS技術檢測腫瘤樣本突變率明顯提高。

2.4MALDI-TOF MS檢測其他基因突變EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制劑在EGFR突變和ALK融合患者中的成功應用，將晚期NSCLC引入了靶向治療的時代。近年來，NSCLC的基因組研究發(fā)現(xiàn)了其他潛在的治療靶點，包括ROS1重排、RET融合、MET擴增，以及BRAF、HER2、PIK3CA、ERBB2、NRAS、KIT突變等。攜帶這些基因組變化的NSCLC可能作為其他適應癥或臨床開發(fā)藥物的靶點，具有潛在的臨床治療意義。Wen等[42]采用Sequenom MALDI-TOF MS檢測NSCLC患者19個基因238個熱點突變，結果發(fā)現(xiàn)攜帶KIT基因突變的患者均存在其他突變，如BRAF、EGFR、PIK3CA、HRAS和AKT等，其中最常見的共存突變基因是EGFR。存在PIK3CA突變的患者也通常伴有EGFR或KRAS突變。有學者通過RT-PCR驗證了MALDI-TOF MS多基因突變檢測結果，發(fā)現(xiàn)在RT-PCR所檢測的熱點突變中，MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)的RT-PCR檢測結果幾乎一致。另有研究發(fā)現(xiàn)，組織DNA量會影響分析結果：當10%以上的等位基因出現(xiàn)突變，使用5 ng DNA即可檢測到突變；但當?shù)任换蛲蛔冾l率低于10%時，使用至少10 ng DNA才會檢測到突變。Bonaparte等[43]進一步驗證了DNA量對檢測結果的影響。為了確定能檢測到的突變頻率低的基因所需的最小DNA量，參照HORIZON參考標準，使用分別含EGFRG719A、EGFRL861Q、EGFRT790M、KRASQ61L、BRAFV600E突變的50 ng DNA進行連續(xù)稀釋(50%、10%、5%和2.5%)，發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS敏感性因檢測的特定基因突變而異。檢測EGFRG719A和T790M突變使用1.25 ng DNA即可，而EGFRL861Q、KRASQ61L和BRAFV600E突變需要5 ng DNA才可被檢測到。Magliacane等[44]研發(fā)了一種基于MALDI-TOF MS多重基因分型平臺PentaPanel，用于評估5個臨床相關癌癥基因(EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA)的56個突變熱點的單核苷酸多態(tài)性，結果顯示，PentaPanel是一種強大的高通量平臺，只需低至8 ng的DNA模板就能同時評估多種基因狀態(tài)，可在一次運行中對10例選擇靶向治療的患者進行基因分型，實際周轉時間僅為2個工作日。為了驗證PentaPanel平臺的準確性，該學者對所有研究樣本進行Sanger測序。結果顯示，兩種方法總體一致率為97.8%，所有1 025個樣本中經(jīng)Sanger測序的不可分析樣本數(shù)量為28個，成功率為97.3%，MALDI-TOF MS PentaPanel平臺不可分析樣本數(shù)量為5個，成功率高達99.5%，且PentaPanel MALDI-TOF MS平臺的特異性為100%。MALDI-TOF MS技術可以為NSCLC相關基因突變分析提供即時、準確的多重檢測方法。此外，其極高的靈活性可用于靶向治療選擇快速進行，具有發(fā)掘新的生物學標志物的潛力。

4 小結及展望

以上研究顯示了MALDI-TOF MS的強大功能，但也面臨著一系列挑戰(zhàn)。首先，MALDI-TOF MS目前只能檢測已知的基因突變；其次，當前基因突變研究分析的樣本仍是以組織樣本為主，液體活檢作為驅動基因檢測替代品的研究主要集中于EGFR檢測方面，且樣本量較少。然而對晚期NSCLC患者來說獲取組織樣本是一種侵入性操作，可能增加意外并發(fā)癥的風險，無創(chuàng)的基因檢測能夠指導更為精準的個體化治療。因此，作為一種非侵入性技術，MALDI-TOF MS檢測外周血基因突變是一種新的策略，能夠補充傳統(tǒng)方法的不足之處，以增強MALDI-TOF MS作為高通量基因分型技術在基礎應用和臨床診斷中的地位，是腫瘤驅動基因檢測新的發(fā)展方向，在NSCLC基因突變靶點精準檢測中擁有廣闊前景。