張?zhí)熨n，王春燕，鐘 慧，曾慶麗，李來(lái)生

(南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031)

由于生命物質(zhì)如蛋白質(zhì)、生物酶和核酸等均為手性物質(zhì)，與農(nóng)藥作用時(shí)存在高度的立體選擇性，這使得農(nóng)藥對(duì)映體不僅藥效不同，而且毒理和代謝途徑常存在明顯差異[1]。例如三唑類農(nóng)藥殺菌劑的R-構(gòu)型殺菌作用強(qiáng)，而S-型殺菌作用弱，且生物降解較慢，殘留在土壤、水體和植物中的對(duì)映體最終會(huì)對(duì)人體健康和生殖帶來(lái)嚴(yán)重影響[2]。因此，應(yīng)該科學(xué)全面地評(píng)價(jià)手性農(nóng)藥殘留對(duì)食品安全的影響，并進(jìn)行對(duì)映體含量的監(jiān)測(cè)[3]。

目前，高效液相色譜結(jié)合高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)在農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用日益廣泛[4]，手性分離的關(guān)鍵問(wèn)題是選擇合適的分離材料[5]。目前，纖維素類固定相在農(nóng)藥拆分中應(yīng)用較廣，大多在正相色譜條件下拆分[6-7]。環(huán)糊精類手性固定相是一類常用的多模式手性固定相，其中包結(jié)作用參與手性分離是這類固定相的重要特性[8]。然而由于環(huán)糊精空腔較小(～0.65 nm)，所能包結(jié)的手性物質(zhì)有限[9]。近些年來(lái)，新型的橋聯(lián)環(huán)糊精固定相得到了快速發(fā)展，它能夠通過(guò)多個(gè)環(huán)糊精腔體協(xié)同包結(jié)客體[10]，突破了單個(gè)環(huán)糊精腔體有限的不足，能快速拆分體積較大，數(shù)量更多的手性化合物，這也包括手性農(nóng)藥[11]。

已唑醇屬一種常用高效三唑類手性殺菌劑，甾醇脫甲基化抑制劑，用于防治水稻的紋枯病，也用于各種作物和果樹的白粉病、銹病、黑星病、褐斑病、炭疽病等[12-13]，其手性結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1所示。為此，本文采用實(shí)驗(yàn)室制備的新型橋聯(lián)環(huán)糊精柱，建立了一種測(cè)定臍橙中已唑醇對(duì)映體殘留的LC-MS/MS新方法，以滿足食品中手性農(nóng)藥監(jiān)測(cè)的需要。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Triple TOF 5600+型液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB SCIEX公司)，配有LC30液相色譜系統(tǒng)和Analyst TF 1.7.1數(shù)據(jù)處理軟件；TGL-16C 型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ-100DE 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；AR124CN型電子天平(精度0.000 1 g，奧豪斯儀器(常州)有限公司)；MS 3型渦旋儀(德國(guó) IKA公司)；HR1853型果汁機(jī)(中國(guó)飛利浦公司)；Milli-Q超純水制備裝置(美國(guó)Millipore公司)。

己唑醇外消旋標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度≥99.5%)購(gòu)于上海農(nóng)藥研究院；甲醇(MeOH)、乙腈(ACN) 和甲酸均為色譜級(jí)(美國(guó)Tedia公司)；四氧化三鐵(Fe3O4)，石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)購(gòu)自博納艾杰爾科技公司(天津)，其它分析純?cè)噭┤鐭o(wú)水硫酸鎂(MgSO4)，氯化鈉(NaCl) 等均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。臍橙樣品從南昌市超市中隨機(jī)購(gòu)買。

2.2 己唑醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取一定量的己唑醇外消旋標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后配制成濃度為400 μg·L-1的儲(chǔ)備液，貯存在冰箱中備用(4 ℃)。使用前用甲醇稀釋成所需濃度：0.5,1,2,4,8,20 μg·L-1，由于外消旋標(biāo)準(zhǔn)品中含有等量的R-和S-對(duì)映體，所以每個(gè)對(duì)映體的濃度為：0.25,0.5,1,2,4,10 μg·L-1，用濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析。

2.3 臍橙樣品的前處理

采用改進(jìn)的QuEChERS 法[14]進(jìn)行樣品前處理，盡可能除去臍橙中的色素、脂、果糖和果酸類等干擾物。將臍橙洗凈，切成小塊，然后制成果漿，取10 g果漿于小管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min。然后加入1 g NaCl和4 g無(wú)水MgSO4，渦旋1 min后離心5 min，靜置1 min。將上清液轉(zhuǎn)入含1 g MgSO4的離心管中振搖，靜置分層。移取上層清液1 mL于含40 mg 石墨化炭黑(GCB)、50 mg N-丙基乙二胺填料(PSA)、60 mg Fe3O4磁粒，渦旋1 min，靜置1 min。用外部磁鐵使提取液快速澄清，用濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

2.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：橋聯(lián)β-環(huán)糊精柱(250 mm× 4.6 mm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸混合溶液，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為2 μL，柱溫設(shè)為20 ℃。

質(zhì)譜參數(shù)：正離子模式下(ESI+)掃描，毛細(xì)管電壓+5 500 V，脫溶劑溫度650 ℃，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：100～400 m/z，二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：60～80 m/z，一級(jí)和二級(jí)碰撞能量(CE)分別為：10和30 V，定量離子分別為314和70 m/z。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相組成及酸度的選擇

為了實(shí)現(xiàn)己唑醇對(duì)映體的快速分離，首先優(yōu)化流動(dòng)相的組成，用常見(jiàn)的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種流動(dòng)相都能實(shí)現(xiàn)己唑醇的完全拆分，但甲醇比乙腈分離度更好，且價(jià)格較便宜，本實(shí)驗(yàn)選用了甲醇作為有機(jī)改性劑。也考察了流動(dòng)相的酸度對(duì)拆分的影響，結(jié)果顯示pH值的變化對(duì)分離的影響不大，考慮到已唑醇屬堿性農(nóng)藥，三唑基上多個(gè)氮原子易被質(zhì)子化，有利于提高電噴霧正離子化的效率，從而提高檢測(cè)的靈敏度，故選用甲醇-0.1%甲酸作為流動(dòng)相。甲醇的含量對(duì)已唑醇的手性分離度有重要影響，隨著流動(dòng)相中甲醇含量的提高，分離度是先升后降，綜合考慮分析時(shí)間、分離度和檢測(cè)靈敏度，流動(dòng)相的最終組成為甲醇-0.1%甲酸(32:68V/V)。

3.1.2 柱溫的選擇

環(huán)糊精手性固定相的空腔結(jié)構(gòu)會(huì)受溫度的影響，加之溫度也會(huì)影響到已唑醇保留時(shí)間、分離度和柱效，最終影響手性農(nóng)藥的分離效果[14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在室溫附近可實(shí)現(xiàn)完全分離，為便于溫度控制，確保己唑醇分離的重現(xiàn)性，本實(shí)驗(yàn)將柱溫設(shè)置為20 ℃。

3.1.3 流速和進(jìn)樣量的選擇

除了上述兩個(gè)主要影響因素外，流動(dòng)相流速和進(jìn)樣量對(duì)分離結(jié)果也有一定的影響，為此本文考察了不同流速(0.2～1.2 mL·min-1)的影響。發(fā)現(xiàn)流速越高，溶質(zhì)被洗脫越快，保留時(shí)間變短，固定相與溶質(zhì)間的作用時(shí)間縮短，分離度下降；當(dāng)流速較低時(shí)，固定相與溶質(zhì)能充分作用，但色譜峰會(huì)展寬。綜合考慮分離度和分析時(shí)間，流速設(shè)置為1 mL·min-1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量太小，靈敏度低，受背景噪聲影響較大；而進(jìn)樣量太大，容易造成柱超載，色譜峰變形(前沿或拖尾)，會(huì)影響分離度和峰面積定量的準(zhǔn)確性，所以選擇一個(gè)適中的進(jìn)樣量(2 μL)。

3.2 優(yōu)化的分離條件

采用實(shí)驗(yàn)室自制的橋聯(lián)β-環(huán)糊精柱，以甲醇-0.1%甲酸(32:68V/V)為流動(dòng)相；柱溫為20 ℃；流速為1 mL.min-1；進(jìn)樣量為2 μL；采用一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜選擇正離子檢測(cè)，具體的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)第2.4節(jié)所示。在上述優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)己唑醇對(duì)映體進(jìn)行手性拆分和定量分析，分析時(shí)間均在20 min以內(nèi)，得到了較滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。已唑醇外消旋標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖見(jiàn)圖2所示。

3.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

采用第2.3節(jié)中配制的己唑醇外消旋標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其中單一對(duì)映體濃度分別為0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,10 μg·L-1，按上述優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)單個(gè)對(duì)映體的峰面積(y)與相應(yīng)濃度(x,μg·L-1)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如下：

己唑醇第一個(gè)對(duì)映體：y=7.068×105x-3.052×105r2=0.993 3

己唑醇第二個(gè)對(duì)映體：y=7.332×105x-3.876×105r2=0.993 0

兩個(gè)己唑醇對(duì)映體在測(cè)定的濃度范圍(0.25～10 μg·L-1)具有良好的線性關(guān)系，按三倍信噪比(S/N=3) 推算出己唑醇的最低檢出限為0.017 μg·L-1。

3.3.2 回收率和精密度試驗(yàn)

色譜方法開發(fā)出來(lái)，最終目的是應(yīng)用到實(shí)際的農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中，由于含有已唑醇的實(shí)際樣品很難獲得。因此本實(shí)驗(yàn)在臍橙空白基質(zhì)中分別添加了一定量的己唑醇外消旋標(biāo)準(zhǔn)品，即得模擬樣品。對(duì)其進(jìn)行回收率和重現(xiàn)性試驗(yàn)，以便考察該方法的準(zhǔn)確度和精密度。添加了低中高3種濃度水平(1,2,4 μg·L-1) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平都進(jìn)行了5次平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：己唑醇第一個(gè)對(duì)映體平均RSD為2.12%，平均回收率為94.57%；己唑醇第二個(gè)對(duì)映體平均RSD為2.28%，平均回收率為92.46%；結(jié)果表明該對(duì)映體的定量方法有較高的精密度和準(zhǔn)確性。添加外消旋已唑醇樣品的色譜圖見(jiàn)圖3所示。

4 結(jié)論

采用一種自制的新型橋聯(lián)β-環(huán)糊精柱和簡(jiǎn)單的流動(dòng)相可完全拆分己唑醇對(duì)映體，并結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，能在短時(shí)間內(nèi)(20 min) 快速測(cè)定臍橙中已唑醇對(duì)映體。該方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，成本低，實(shí)用性較強(qiáng)，可用于果蔬樣品中手性農(nóng)藥對(duì)映體殘留量的檢測(cè)，為食品安全檢測(cè)提供了一種新分離材料和快速的LC-MS/MS分析方法。