陳彥伶　何金英　胡成剛　唐娟　莫雅蜜　朱睿香

【摘 要】 目的：觀察苦皮藤不同提取部位對類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞（HFLS-RA）增殖的影響，及其對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導的HFLS-RA中細胞因子表達的影響。方法：制備苦皮藤水提物（A）及其醇提物（B），對醇提物根據(jù)極性大小進行萃取，得到石油醚部位（C）、二氯甲烷部位（D）、乙酸乙酯部位（E）、正丁醇部位（F）、剩余層部位（G）。噻唑藍（MTT）法檢測苦皮藤各部位不同濃度（10、20、40、80、160μg/mL）干預細胞24h、48h、72h，對細胞增殖的抑制作用;TNF-α（20ng/mL）體外誘導HFLS-RA增殖，加入不同濃度的各個提取部位（10，40，160μg/mL）作用72h后，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細胞上清中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）、前列腺素E2（PGE2）的含量。結果：MTT結果表明，苦皮藤的B、C、D（80，160μg/mL）能顯著抑制HFLS-RA細胞的增殖（P<0.01），呈時間和劑量依賴性;A、E、F、G四組對細胞的活力均無明顯影響。ELISA結果顯示，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2含量均顯著提高（P<0.01）;與TNF-α組比較，B、C、D（40，160μg/mL）能顯著抑制IL-1β的表達（P<0.05，P<0.01），具有劑量依賴性;C（40，160μg/mL）能顯著抑制IL-6的表達（P<0.05），D（160μg/mL）能顯著抑制IL-6的表達（P<0.05）;C、D（160μg/mL）能顯著降低MMP-3含量（P<0.05）;A、B、D（160μg/mL）可抑制PGE2的表達（P<0.05），C（40、160μg/mL）能顯著抑制PGE2的表達（P<0.05，P<0.01）。結論：苦皮藤可抑制HFLS-RA增殖及其分泌IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2的能力。

【關鍵詞】 苦皮藤;類風濕關節(jié)炎;類風濕性關節(jié)炎成纖維滑膜細胞;腫瘤細胞因子-α;細胞因子

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）4-0014-07

Effects of Celastrus Angulatus on Human Rheumatoid Arthritis Fibroblast Synovial Cells

Proliferation and Expression of Related Cytokines

CHEN Yanling HE Jinying HU Chenggang* TANG Juan MO Yami ZHU Ruixiang

Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China

Abstract：Objective To observe the effects of different extracts from Celastrus angulatuson the proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells （HFLS-RA） and their effects on the expression of cytokines in HFLS-RA induced by tumor necrosis factor-α （TNF-α）.Methods The water extract （A） and alcohol extract （B） were prepared，and the alcohol extract was extracted according to polarity to obtain petroleum ether extract （C），dichloromethane extract （D），and ethyl acetate extract （E） ，Butanol extract （F），residual layer extract （G）.The MTT method was used to detect the inhibitory effects of various extraction sites （10、20、40、80and 160 μg/mL） on the cell proliferation for 24h、48hand 72h.HFLS-RA were induced in vitro by using TNF-α （20ng/mL），and treatment with different concentrations （10，40，160 μg/mL） for 72 hours，The enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the contents of interleukin-1β （IL-1β），interleukin-6 （IL-6），matrix metalloproteinases-3 （MMP-3），and Prostaglandin E2 （PGE2） in the cell supernatant.Result The MTT results showed that B，C，and D （80，160 μg/mL） significantly inhibited proliferation of HFLS-RA （P<0.01） in a time-dependent and dose-dependent manner.The four groups A，E，F(xiàn) and G had no significant effect on cell viability.ELISA results showed that compared with the blank group，the levels of IL-1β，IL-6，MMP-3，and PGE2 in the supernatant of the TNF-α group were significantly increased （P<0.01）; Compared with the TNF-α group，B，C ，D （40，160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of IL-1β （P<0.05，P<0.01），which is dose-dependent; C （40，160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of IL-6 （P<0.05），D （160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of IL-6 （P<0.05）; C and D （160 μg/mL） significantly reduced the content of MMP-3 （P<0.05）; A，B，D （160μg/mL ） can inhibit PGE2 expression （P<0.05），C （40，160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of PGE2 （P<0.05，P<0.01）. Conclusion C.angulatus can inhibit HFLS-RA proliferation and its ability to secrete IL-1，IL-6，MMP-3，and PGE2.

Key words：Celastrus Angulatus; Rheumatoid Arthritis; Human Fibroblast-like Synoviocyte Rheumatoid Arthritis; Tumornecrosisfactor-α; Cytokines

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以關節(jié)滑膜炎及自身抗體分泌為特點的慢性自身免疫性疾病[1]，其病因及發(fā)病機制比較復雜。研究認為，炎癥、滑膜增生及骨破壞為RA主要的病理特征，治療時可從抑制炎癥反應、抑制滑膜細胞增殖、抑制軟骨損傷和骨侵蝕幾方面入手[2-3]。滑膜成纖維細胞（Fibroblast-Likessynoviocytes，F(xiàn)LS）在RA發(fā)病中起關鍵作用，在病理狀態(tài)下FLS表現(xiàn)為異常增殖及凋亡不足，能分泌高水平促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17，還能分泌化學趨化因子、基質蛋白降解酶等[4]。

苦皮藤Celastrus angulatus Maxim.為衛(wèi)矛科南蛇藤屬苦皮藤的干燥根，具有祛風除濕、活血通經、解毒殺蟲的功效，可治療風濕痹痛、骨折傷痛、瘡瘍潰爛等病[5-6]?？嗥ぬ僦谢瘜W成分豐富，含有倍半萜類、三萜類、二萜類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油等成分[7]?？嗥ぬ倬哂袣⑾x、殺菌、抗癌等活性，其中殺蟲活性研究較為深入，已有成熟的殺蟲制劑[8]。但關于苦皮藤抗風濕作用的研究在國內外尚無具體報道。根據(jù)文獻記載[9]，苦皮藤配伍藤蘿根、白金條泡酒服用可治療風濕、勞傷、關節(jié)疼痛。由此，為驗證苦皮藤的抗風濕作用，尋找其有效成分及其作用機制，可對苦皮藤進行深入研究。實驗以TNF-α誘導的人類風濕性關節(jié)炎成纖維滑膜細胞模型，研究苦皮藤不同提取部位的抗風濕作用，為篩選苦皮藤抗風濕有效部位及研究其作用機制提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株HFLS-RA類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞（貨號：JNO-02001），購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物制備 稱取8mg藥物，充分溶于1mL DMSO中，制成8mg/mL的母液，用0.22μm的微孔濾膜過濾，4℃條件下保存。

1.3 試劑 胰酶（+EDTA，批號：J180035，Hyclone）;南美胎牛血清（批號：JC63468，CLARK）;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：WH01111903XP，Procell）;雙抗（批號：J180034，Hyclone）;MTT（批號：EZ2811A179，Biofroxx）;二甲基亞砜（DMSO，批號：SHBJ7919，Sigma）;TNF-α（貨號：300-01A-10，Peprotech）;IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2檢測試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司。

1.4 儀器 倒置生物顯微鏡（AE31，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）;酶標儀（SpectraMAX Plus384，Molecular Devices）;壓力蒸汽滅菌器（SYQ-DSX-280B，上海宜川儀表廠）;CO2培養(yǎng)箱（MCO-15AC，三洋電機國際貿易有限公司）;臺式低速離心機（TDZ4-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法檢測苦皮藤對HFLS-RA增殖活性的影響 取對數(shù)生長期的HFLS-RA細胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化后收集，1000rpm離心5min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液，調節(jié)細胞密度3.5×104/mL，200μL/孔接種于96孔板中，每種藥物分別設置空白對照組、160、80、40、20、10μg/mL組，每組5重復，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入對應藥物。待藥物分別作用24、48、72h后，吸棄上清，每孔加入200μL終濃度為0.5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄液體，每孔加入150μL DMSO，避光振蕩10min，用酶標儀測定其在490nm處的吸光度（OD）值，計算細胞的生存率。

2.2 ELISA法檢測TNF-α誘導的HFLS-RA中相關細胞因子的表達 取對數(shù)生長期的HFLS-RA細胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化收集，1000rpm離心5min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液，調節(jié)細胞密度7×104/mL，2mL/孔接種于24孔板中，24h細胞貼壁后棄去上清液，設置空白組、模型組、樣品組，每組3重復。空白組不加藥物及TNF-α，模型組用不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)預處理1h后，加入1mL 20ng/mL的TNF-α，樣品組分別加入質量濃度為10、40、160μg/mL的7種不同藥物1mL，預處理1h后，再加入1mL TNF-α，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，72h后收集上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的含量。

2.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料滿足正態(tài)分布以（x[TX-*3]±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用最小顯著差（LSD）法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 苦皮藤對HFLS-RA增殖的影響 采用MTT法測定OD值，通過公式計算細胞活力可以看出，TNF-α誘導組細胞活力最高，可以促進HFLS-RA增殖。結果表明，隨著干預時間的延長，各組OD值降低，抑制率逐步升高，呈時間和劑量依賴性。藥物干預24h，與空白組比較，A、C組（10μg/mL），B、E組（10，20，40μg/mL）差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。A、E、F、G組對細胞增殖無明顯抑制作用，且在較低濃度時對細胞增殖有促進作用;C、D組在高劑量下對細胞增殖有一定抑制作用（見圖2）。

藥物干預48h，與空白組比較，A、B、G組（10，20μg/mL），F(xiàn)組（10，20，40μg/mL）差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。C、D組可明顯抑制HFLS-RA的增殖（見圖3）。

藥物干預72h，與空白組比較，A、E組（10μg/mL），F(xiàn)組（10，20，40μg/mL），G組（10，20μg/mL）差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。各組隨著給藥濃度增加，對細胞增殖均出現(xiàn)不同程度的抑制作用，并呈劑量依賴性，其中C、D組（160μg/mL）對HFLS-RA的增殖有明顯抑制作用（見圖4）。石油醚部位作用24h、48h、72h的IC50值分別為156.38、75.044、61.347μg/mL，二氯甲烷部位作用48h、72h的IC50值分別為94.571、63.513μg/mL，其余部位無法獲取IC50。在ELISA實驗中采用高、中、低（160、40、10μg/mL）3個劑量來考察苦皮藤各個部位對相關細胞因子的影響。

3.2 苦皮藤對HFLS-RA分泌細胞因子的影響

3.2.1 苦皮藤對IL-1β的影響 由表1可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中IL-1β含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，B、C、D組（40，160μg/mL）中IL-1β含量均明顯降低（P<0.05，P<0.01），且各組對IL-1β的作用呈一定的濃度依賴關系;E組（160μg/mL）中IL-1β含量極顯著降低（P<0.01）。

3.2.2 苦皮藤對IL-6的影響 由表2可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中IL-6含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，C組（40，160μg/mL）中IL-6含量均明顯降低（P<0.05），呈一定的濃度依賴關系;D組（160μg/mL）中IL-6含量顯著降低（P<0.05）。

3.2.3 苦皮藤對MMP-3的影響 由表3可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中MMP-3含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，C、D組（160μg/mL）中MMP-3含量均明顯降低（P<0.05）。

3.2.4 苦皮藤對PGE2的影響 由表4可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中PGE2含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，C組（40，160μg/mL）中PGE2含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），呈一定的濃度依賴關系;A、B、D組（160μg/mL）中PGE2含量均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。

4 討論

研究認為，滑膜成纖維細胞（FLS）在炎癥反應的發(fā)展和關節(jié)破壞過程中起著重要作用，能直接破壞軟骨和骨組織，是治療RA的重要靶點[10]。FLS可合成并分泌腫瘤細胞因子、白細胞介素、干擾素、趨化因子、集落刺激因子、生長因子等多種因子，如IL-6、IL-8、PGE2、膠原酶、基質金屬蛋白酶等，這些炎癥介質均參與滑膜炎癥反應并最終導致關節(jié)破壞[11]。本實驗通過研究苦皮藤對HFLS-RA細胞增殖及分泌炎癥因子的抑制能力，初步分析苦皮藤抗風濕有效部位及可能機制。

MTT法檢測苦皮藤對細胞增殖活性的影響實驗表明，隨著時間延長及給藥濃度增加，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余層部位對細胞的增殖均無明顯抑制作用;石油醚部位與二氯甲烷部位對細胞的抑制率逐步升高，呈時間和劑量依賴性，當給藥濃度為160μg/mL，干預72h時抑制率最高，抑制效果最佳，抑制率分別達到90.701%、91.318%。ELISA法檢測苦皮藤對細胞分泌炎癥因子含量的影響實驗表明，TNF-α可誘導HFLS-RA分泌高水平的IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2，體現(xiàn)其促炎功能。石油醚部位及二氯甲烷部位（160μg/mL）能顯著抑制相關細胞因子的表達（P<0.05，P<0.01），提示這兩個部位可能通過抑制HFLS-RA分泌細胞因子，從而減少炎癥因子的產生與釋放;其余部位均沒有明顯的抑制作用。綜上，苦皮藤中具有抑制HFLS-RA增殖及其分泌炎癥因子能力的有效成分集中在石油醚部位及二氯甲烷部位。

苦皮藤中富含萜類成分，主要集中在小極性部位[12]。研究表明，萜類成分具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)等廣泛的生物活性[13-14]。其中倍半萜類化合物可通過抑制NF-κB，MAPKs和STAT等信號通路相關因子的活化，下調TNF-α、PGE2、NO、IL-1、IL-6、IL-8等炎性因子的蛋白表達，實現(xiàn)抗炎作用[15]。由此推測苦皮藤抗風濕作用可能與萜類成分相關，尚待進一步實驗驗證。

綜上所述，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余層部位對細胞增殖及相關細胞因子的表達均無明顯抑制作用;石油醚部位與二氯甲烷部位可抑制HFLS-RA的異常增殖，并能夠顯著降低IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的表達水平，為下一步探究苦皮藤抗風濕有效成分及其作用機制奠定基礎。

參考文獻

[1]劉肅，張鑫，王春生.類風濕性關節(jié)患者血清炎性細胞因子水平及其臨床意義分析[J].基因組學與應用生物學，2018，37（9）：4100-4105.

[2]B.AUID-ORCID HTTP ORCID ORG X.WILLIAMS，A.DHARMAPATNI，T.CROTTI.Intracellular apoptotic pathways：a potential target for reducing joint damage in rheumatoid arthritis[J].Inflammation Research，2018，67（3）：219-231.