何乾超　林潔潔　高玉廣　張志偉　黃德慶　張?jiān)⒂垒x　陳煒

【摘 要】 目的：探討柴胡疏肝湯對癲癇大鼠微RNA132（miRNA132）、核因子kB（NF-kB）表達(dá)的影響。方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠分為癲癇組、假手術(shù)組、空白組，癲癇組采用腹腔注射氯化鋰溶液聯(lián)合鹽酸匹羅卡品誘發(fā)癲癇模型，建立癲癇模型后，篩選出造模成功大鼠，隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組，中藥組用柴胡疏肝湯灌胃，西藥組給予卡馬西平片，模型組及其他各組給予同等量的生理鹽水灌胃，最后比較各組的大鼠的癇性發(fā)作情況，并用PCR檢測各組大鼠海馬及顳葉皮層中miRNA132、NF-kB的mRNA的表達(dá)。結(jié)果：①空白組和假手術(shù)組無癇性發(fā)作，模型組1～4周的癇性發(fā)作級別數(shù)值無變化，西藥組和中藥組的癇性發(fā)作從1～4周逐次減少。第1周，模型組與中藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值無變化（P>0.05），西藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值低于模型組 （P<0.05）。第2～4周，中藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值均低于模型組（P<0.05），西藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值均低于中藥組（P<0.05）。②空白組和假手術(shù)組的miRNA132表達(dá)無差別（P>0.05），模型組的miRNA132表達(dá)低于假手術(shù)組（P<0.05），中藥組的miRNA132表達(dá)高于模型組（P<0.05），西藥組的miRNA132表達(dá)高于中藥組（P<0.05）。③空白組和假手術(shù)組的NF-kB的mRNA表達(dá)無差別（P>0.05），模型組的NF-kB的mRNA高于假手術(shù)組（P<0.05），中藥組的NF-kB的mRNA低于模型組（P<0.05），西藥組的NF-kB的mRNA低于中藥組（P<0.05）。結(jié)論：柴胡疏肝湯可以提高miRNA132，減少NF-kB表達(dá)，減少癲癇大鼠的癇性發(fā)作。

【關(guān)鍵詞】 柴胡疏肝湯;癲癇;miRNA132;NF-kB

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）4-0021-05

癲癇是腦部組織神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致中神經(jīng)系統(tǒng)功能短暫失常的疾病，臨床癥狀以反復(fù)發(fā)生抽搐及短暫意識變化為主，是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前全世界約有五千萬癲癇患者，其中90%的患者在發(fā)展中國家。中國癲癇患病率為4‰～7‰，其中活動性癲癇患病率為4.6‰[1]。許多癲癇患者主要是采取藥物治療控制，但還有高達(dá)30%患者反復(fù)發(fā)作、病情難控制，嚴(yán)重干擾著患者的生活及工作[2]。癲癇神經(jīng)元高興奮性與癲癇形成過程中的炎性反應(yīng)和炎癥介質(zhì)密切相關(guān)，尤其是核因子kB（NF-kB）途徑，NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核，然后再與相應(yīng)靶序列接合，控制靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，NF-kB參加炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等過程，與癲癇密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能使癲癇患者神經(jīng)元突觸周圍蛋白質(zhì)異常表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)癲癇發(fā)作[4]。miRNA132表達(dá)與癲癇的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miRNA132上調(diào)可提高神經(jīng)元興奮性，且調(diào)節(jié)過表達(dá)的miRNA132可減輕癲癇的癇性發(fā)作，但是目前尚缺乏中醫(yī)藥對關(guān)鍵因子調(diào)控miRNA132的研究[5]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》中對“癲癇”的記載，認(rèn)為癲癇發(fā)作與肝失疏泄，氣機(jī)逆亂關(guān)系密切，其發(fā)病原因也不離風(fēng)、火、痰、食，基本的發(fā)病病機(jī)為痰涎雍滯、迷閉孔竅，痰在癲癇的發(fā)病中起非常重要的作用。因此，治療上常以化痰解郁，疏肝理氣為治法。柴胡疏肝湯出自《景岳全書》，是疏肝理氣的經(jīng)典方。柴胡疏肝湯組成由柴胡、香附、白芍、川芎、枳殼、陳皮、甘草組成，功效是疏肝行氣，活血止痛。方中柴胡功善疏肝解郁，使肝木條達(dá)，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)柴胡具有疏肝解郁、鎮(zhèn)痛、消炎、鎮(zhèn)靜等抑制中樞的作用;香附理氣疏肝而止痛，川芎活血行氣以止痛，二藥相合，助柴胡以解肝經(jīng)之郁滯，并增行氣活血止痛之效，共為臣藥;陳皮、枳殼理氣行滯，芍藥斂陰柔肝，甘草養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，調(diào)和諸藥，為使藥;諸藥相合，共奏疏肝行氣、活血止痛之功。李華霞[6]等對柴胡疏肝湯治療癲癇進(jìn)行了系統(tǒng)評價，發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝湯加味具有明顯的抗癲癇作用。我們認(rèn)為癇病的病機(jī)與肝的疏泄功能異常關(guān)系密切，其風(fēng)、痰、癖產(chǎn)生均為肝氣失于疏泄、條達(dá)的病理變化，提出了“從肝論治”，運(yùn)用加味柴胡疏肝湯（柴胡 12g、陳皮 12g、川芎 9g、炒枳殼 9g、芍藥 9g、香附 9g、炙甘草 6g、浙貝母 12g）治療癲癇。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用柴胡疏肝湯治療能夠明顯減少患者癇性發(fā)作的頻次，改善了患者腦電圖變化，增強(qiáng)治療的效果[7-9]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，加味柴胡疏肝湯能夠升高miRNA-204的表達(dá)，減少神經(jīng)元細(xì)胞過度自噬，保護(hù)神經(jīng)功能從而達(dá)到治療癲癇的作用[10]。柴胡疏肝湯還可以通過調(diào)節(jié)外周色氨代謝產(chǎn)物及癲癇小鼠色氨酸代謝通路治療癲癇[11]。柴胡疏肝湯干預(yù)不同靶點(diǎn)及信號通路能減少癲癇的發(fā)作次數(shù)，隨著miRNA作為癲癇的生物標(biāo)志物開始被重視，對miRNA的作用靶點(diǎn)及涉及的信號通路進(jìn)一步深入探討研究，將研究出更多作用在這些靶點(diǎn)的藥物從而根本上減少及抑制癲癇發(fā)作，減輕癲癇發(fā)作對人體生理病理引起的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期基礎(chǔ)，運(yùn)用柴胡疏肝湯對癲癇大鼠模型進(jìn)行干預(yù)治療，觀察柴胡疏肝湯對癲癇大鼠miRNA132的影響，從而探討柴胡疏肝湯治療癲癇與調(diào)控miRNA132表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 清潔級雄性SD大鼠120只，年齡3～4個月，體重170～210g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司供應(yīng)，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，動物合格證號：2015000536122。所有大鼠在室溫（23～25 ℃），濕度為45%～55%，光照12 h/d，自由進(jìn)水進(jìn)食，經(jīng)過7d時間的適應(yīng)后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑 柴胡疏肝湯由柴胡12g、陳皮12g、川芎9g、炒枳殼9g、芍藥9g、香附9g、炙甘草6g、浙貝母12g按比例調(diào)配，中藥由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，中藥制劑室煎煮濃煎至1g/mL，放于4℃冷藏備用?？R西平片（上海福達(dá)制藥有限公司），氯化鋰（批號：310468，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），匹羅卡品 （天津金耀氨基酸有限公司），硫酸阿托品注射液（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司），地西泮注射液（天津藥業(yè)焦作有限公司），RNAwait非凍型組織RNA保存液（批號：SR0020，Solarbio）， Trlzol Reagent （批號：184608，Ambion），SYBR Green qPCR Mix （批號：140321，Monad），MonScript RTIII all-in-one Mix（批號：RN05004S，Monad）。

1.3 儀器 AR2140電子分析天平（OHAUS），5417R高速冷離心機(jī)（Thermo Multiskan公司），ABI7600定量PCR儀器（美國LIFE公司）。

1.4 模型制備 造模方法參考Cell Reports雜志報(bào)道的以腹腔注射氯化鋰溶液聯(lián)合鹽酸匹羅卡品這種化學(xué)點(diǎn)燃方法[12]為主，先對實(shí)驗(yàn)大鼠向腹腔注射氯化鋰溶液127mg/kg，20 h后再注射匹羅卡品50mg/kg（處理前30min先給予硫酸阿托品注射液1mg/kg以對抗匹羅卡品所致的外周性的膽堿能反應(yīng)），匹羅卡品注射后參照Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[13]觀察大鼠行為學(xué)變化，0級：沒有抽搐發(fā)作;1級：存在有面部痙攣;2級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭;3級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭、一側(cè)前肢陣攣;4級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立;5級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立、跌倒。達(dá)到4～5級并進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）的大鼠為癲癇誘導(dǎo)成功;沒有發(fā)作或沒有達(dá)到 4級的大鼠不納入本研究。如果癲癇狀態(tài)持續(xù)達(dá)1 h，則采取注射地西泮10mg/kg 終止發(fā)作。癲癇持續(xù)狀態(tài)后的大鼠度過急性期24 h后，進(jìn)入潛伏期（10 d），在潛伏期，每天采用5%的葡萄糖氯化鈉注射液5mL注射，2次/d，潛伏期后進(jìn)入慢性期。癲癇持續(xù)狀態(tài)后，用監(jiān)控視頻系統(tǒng)連續(xù)記錄。每個鼠籠放置八只大鼠，用苦味酸進(jìn)行記號，檢測時間24 h，觀察時期為慢性期的四周。

1.5 動物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為①癲癇組（n=72），②假手術(shù)組（n=24），③空白組（n=24），癲癇組采用上述方法進(jìn)行造模，空白組無需任何處理，假手術(shù)組僅用腹腔注射生理鹽水造模。造模成功后，將72只模型大鼠隨機(jī)分為 3 組，分別是模型組、中藥組、西藥組。中藥組給予柴胡疏肝湯水煎劑灌胃給藥，西藥組給予卡馬西平片，其余各組給予同等量的生理鹽水灌胃，以2mL/100g 體重灌胃給藥，每日 1 次，灌胃的時間為4 周。

1.6 取材及組織處理??? 用10%水合氯醛（劑量10mg/kg），腹腔注射麻醉各組大鼠，然后以仰臥位，將其四肢固定于解剖硬板上，打開胸部，暴露心臟后，將灌注有生理鹽水針頭插入左心室，把右心耳剪掉，與此同時，快速灌注生理鹽水，隨即，進(jìn)行斷頭取腦，繼續(xù)用生理鹽水沖去殘余血液，在大腦中下三分之一交界處，剝離出雙側(cè)海馬組織，與此同時，剝開顳葉皮層，放置于RNA保護(hù)液中，再放入-80℃冰箱中保存。

1.7 觀測指標(biāo)與方法

1.7.1 癇性發(fā)作行為記錄 24 h監(jiān)測大鼠癇性發(fā)作行為改變，參照Racine分級標(biāo)準(zhǔn)（0級：沒有抽搐發(fā)作;1級：存在有面部痙攣;2級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭;3級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭、一側(cè)前肢陣攣;4級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立;5級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立、跌倒）觀察大鼠行為學(xué)變化進(jìn)行評分。

1.7.2 miRNA-132 、NF-kB的 mRNA 的PCR 檢測 提取總 RNA，擴(kuò)增 mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，應(yīng)用 PCR 方法對NF-kB、miRNA-132的 mNRA 水平進(jìn)行檢測。記錄每個反應(yīng)管中標(biāo)本的Ct值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行分析。△CT=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料滿足正態(tài)分布的前提下，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，三組樣本均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組癇性發(fā)作情況 由表1可知，空白組和假手術(shù)組無癇性發(fā)作，模型組1～4周的癇性發(fā)作級別數(shù)值無變化，西藥組和中藥組的癇性發(fā)作從1～4周逐次減少。第1周，模型組與中藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值無變化（P>0.05），西藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值低于模型組 （P<0.05）。第2～4周，中藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值均低于模型組（P<0.05），西藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值均低于中藥組（P<0.05）。

2.2 miRNA132、NF-kB的mRNA表達(dá) 由表2可知，空白組和假手術(shù)組的miRNA132表達(dá)無差別（P>0.05），模型組的miRNA132表達(dá)低于假手術(shù)組（P<0.05），中藥組的miRNA132表達(dá)高于模型組（P<0.05），西藥組的miRNA132表達(dá)高于中藥組（P<0.05）?？瞻捉M和假手術(shù)組的NF-kB表達(dá)無差別（P>0.05），模型組的NF-kB表達(dá)高于假手術(shù)組（P<0.05），中藥組的NF-kB表達(dá)低于模型組（P<0.05），西藥組的NF-kB表達(dá)低于中藥組（P<0.05）。

3 討論

癲癇最早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載，稱“羊角風(fēng)”、“羊癇風(fēng)”等，中醫(yī)歸屬于“癇病”的范疇。癇病的病因病機(jī)與肝失疏泄密切聯(lián)系，其風(fēng)、火、痰的產(chǎn)生均為肝氣失于疏泄、條達(dá)的病理變化，“從肝論治”癇病尤為重要。柴胡疏肝湯是疏肝理氣的常用方，在“從肝論治”的理論下運(yùn)用柴胡疏肝湯治療癲癇，取得了明顯的療效，但是對于柴胡疏肝湯治療癲癇的分子機(jī)制上不清楚，故值得我們進(jìn)一步探究，為臨床上治療癲癇提供理論依據(jù)。

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科常見的疾病之一，其發(fā)病機(jī)制目前尚未清楚，大多數(shù)癲癇患者經(jīng)過規(guī)范藥物治療后，病情可以得到較好的控制，但仍有少部分患者反復(fù)發(fā)作、難以控制。因此，尋找新的治療方式或藥物來更好地改善癲癇患者癥狀，提高治療有效率尤為迫切。miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)較豐富，參與調(diào)控基因表達(dá)，與癲癇發(fā)生的大腦的神經(jīng)病理改變有著密切，并且miRNA可以作用于多個靶點(diǎn)來調(diào)控多條蛋白通路的基因表達(dá)。研究表明，生物體內(nèi)的細(xì)胞中有超過60%的蛋白表達(dá)是通過miRNA調(diào)控的[14]。以miRNA132作為癲癇基因表達(dá)調(diào)控的靶點(diǎn)時，在癲癇發(fā)作后，miRNA132可以減少癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死[15]。神經(jīng)元電活性調(diào)節(jié)后的miRNA132，在神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)突觸重塑方面中發(fā)揮著重要作用，且癲癇發(fā)作的關(guān)鍵原因是神經(jīng)元電活性興奮異常增高[16]。NF-kB是細(xì)胞中較為重要的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)，并且在細(xì)胞的生長過程和凋亡反應(yīng)起著重要的作用，是免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[17]。研究證實(shí)NF-kB在神經(jīng)元變性中起著重要的作用，是通過直接作用于神經(jīng)元本身的基因表達(dá)和間接調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[18]。本實(shí)驗(yàn)通過對miRNA132和NF-kB表達(dá)進(jìn)行干預(yù)后，探討柴胡疏肝湯是否通過調(diào)控miRNA132、NF-kB轉(zhuǎn)錄因子對神經(jīng)元電興奮性產(chǎn)生影響，發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝湯可以減少癲癇患者癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間，減輕腦組織的損傷及還可以改善癲癇模型的異常[6-11，19-23]。