時(shí)文博 高麗娜 韓現(xiàn)芹 李春青 陳永平

摘要：使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測9種天津市售主要經(jīng)濟(jì)貝類中13種麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）的含量，分析PSP的污染現(xiàn)狀和成分特征。結(jié)果顯示，共計(jì)6個(gè)品種（紫貽貝、蝦夷扇貝、牡蠣、毛蚶、脈紅螺、菲律賓蛤仔）檢出PSP。其中蝦夷扇貝、紫貽貝、毛蚶3個(gè)品種的檢出率較高且含量較高，檢出率分別為66.7%、58.3%、58.3%。PSP中檢出率較高的毒素包括N-磺酰胺甲?；惗舅谻1、C2和膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX3，毒力占比主要以膝溝藻毒素GTX1-4為主，毛蚶蓄積STX毒素的能力強(qiáng)于其他貝類。全年的PSP含量季節(jié)變化為夏季最高，冬季最低。PSP主要存在于貝類的消化腺內(nèi)，全年不同月份的PSP含量均在安全食用范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞：麻痹性貝類毒素;LC-MS/MS;污染現(xiàn)狀;特征分析

貝類由于高度的環(huán)境依賴性、食物濾食性等生理特性決定了其質(zhì)量安全狀況極易受外界環(huán)境的影響，是水產(chǎn)品中風(fēng)險(xiǎn)較高的品種。近年來，因食用貝類導(dǎo)致中毒的事件屢有發(fā)生，天津作為貝類消費(fèi)量較大的城市，風(fēng)險(xiǎn)隱患較高。目前市面上的貝類中毒事件大部分都是由貝類毒素導(dǎo)致的。貝類毒素有多種類型，其中分布范圍最大，發(fā)生頻率最高，人體危害最大的是麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）[1-2]，因此對PSP的污染狀況和成分特征進(jìn)行分析顯得尤為重要。

小鼠生物法和液相色譜法是目前PSP主要檢測方法，兩種方法被許多國家采用，但也存在著很多缺陷，如小鼠生物法靈敏度比較差[3]，無法確定毒素的組成和具體含量，液相色譜法操作比較繁瑣、干擾較大[4]。使用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測可以確定PSP各毒素的組成并精確定量，可為進(jìn)一步開展PSP的研究提供有效的技術(shù)手段。

本文使用LC-MS/MS檢測了天津市售主要經(jīng)濟(jì)貝類中13種PSP，分析PSP的成分特征和分布現(xiàn)狀，為監(jiān)管部門開展針對性的監(jiān)控預(yù)警工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1材料和方法

1.1樣品采集

2017年9月至2019年7月，為期兩年采集天津市沿海碼頭捕獲、批發(fā)市場銷售的主要經(jīng)濟(jì)貝類。每兩個(gè)月采樣1次，共12次采集了縊蟶、紫貽貝、四角蛤蜊、蝦夷扇貝、牡蠣、毛蚶、脈紅螺、菲律賓蛤仔、扁玉螺9個(gè)品種的156個(gè)貝類樣品。具體樣品名稱及數(shù)量，見表1。每個(gè)樣品采集3 kg，采樣后送至制樣室處理，用清水清洗貝類，開殼取出全部貝類組織，經(jīng)高速組織攪碎機(jī)攪碎后均分為兩份，將樣品置于-18 ℃保存。

1.2試劑

乙腈（C2H3N）：色譜純;甲酸（CH2O2）：色譜純;乙酸（C2H4O2）：色譜純;甲酸銨（CH5NO2）：優(yōu)級純;氨水（H5NO）：優(yōu)級純。13種麻痹性貝類毒素（PSP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：石房蛤毒素STX，新石房蛤毒素NEO，膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4，N-磺酰胺甲酰基類毒素GTX5、C1、C2，脫甲?；惗舅豥cSTX、dcGTX2、dcGTX3、dcNEO，均購置于加拿大海洋生物研究所（NRC）。

1.3儀器設(shè)備

AB SCIEX 4000QTRAP三重四級桿質(zhì)譜儀;島津LC-20A高效液相色譜儀;Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng);固相萃取裝置;固相萃取小柱Supelco ENVI-Carb;電子天平;均質(zhì)機(jī);漩渦震蕩器;高速冷凍離心機(jī);恒溫水浴鍋;孔徑0.22 μm濾膜;2 mL注射器。

1.4前處理方法

前處理改進(jìn)自吳海燕等[5]，準(zhǔn)確稱取5.0 g貝類組織，置于50 mL塑料離心管內(nèi)，加入5 mL 1%乙酸溶液提取，旋緊蓋子后漩渦混勻2 min，超聲提取10 min。將離心管放入沸水中煮沸5 min后取出，使用流水沖洗管壁使其至室溫。將離心管4 ℃ 10 000 r/min冷凍離心5 min，吸取1.5 mL上清液加入2 mL離心管內(nèi)，加入5 μL 氨水漩渦混勻等待過柱。

依次用3 mL乙腈、3 mL 20%乙腈水溶液（含1%乙酸）、3 mL 0.1%氨水淋洗Supelco ENVI-Carb小柱進(jìn)行活化。準(zhǔn)確量取1 mL提取液導(dǎo)入固相萃取柱，自然流速過柱，待樣品流盡后加入1 mL純水進(jìn)行淋洗。純水流盡加入1 mL 75%乙腈水溶液洗脫，收集洗脫液過0.22 μm濾膜，移至進(jìn)樣瓶中上機(jī)分析。

2結(jié)果與分析

2.1毒力轉(zhuǎn)換與結(jié)果

以STX毒素為標(biāo)準(zhǔn)，將STX的毒性因子設(shè)為1，其它12種毒素根據(jù)其相對于STX的毒性大小確定各自的毒性因子[6]，13種毒素的毒性因子見表2。13種PSP的檢測結(jié)果統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為STX的毒力當(dāng)量（STXeq），來表示樣品PSP的總毒力（單位： μg STXeq/kg）。根據(jù)下列公式計(jì)算：

STXeq=∑ni=1Xi·ri

式中：Xi—各種PSP含量;

ri—毒性因子;

所檢測貝類樣品的PSP總毒力平均結(jié)果見表3。

2.2PSP的種間差異

檢測的156個(gè)樣品中，44個(gè)樣品檢出PSP，檢出率為28.2%。按品種數(shù)統(tǒng)計(jì)，共計(jì)6個(gè)品種檢出PSP，占全部品種數(shù)的66.7%。其中蝦夷扇貝、紫貽貝、毛蚶的檢出率較高且含量較高，3個(gè)品種檢出率分別為66.7%、58.3%、58.3%。從平均檢出濃度范圍來看，蝦夷扇貝為19.3～1634 μg/kg、紫貽貝為15.3～288.5 μg/kg、毛蚶為37.6～149.0 μg/kg，牡蠣、脈紅螺、菲律賓蛤仔檢出率分別為16.6%、20.8%、16.6%，檢出濃度范圍4.9～54.3 μg/kg，濃度較低，其它品種未檢出。

2.3PSP的成分組成特征

13種PSP中有10種檢出，各毒素的檢出率如下：STX為9.6%、GTX1為16.7%、GTX2為19.9%、GTX3為17.9%、GTX4為9.6%、GTX5為9.0%、C1為20.5%、C2為19.2%、dcGTX2為12.2%、dcNEO為3.2%。膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX3和N-磺酰胺甲?；惗舅谻1、C2的檢出率較高，說明PSP主要由于中、低毒力的毒素組成，高毒力毒素僅GTX1檢出率比較高。毛蚶體內(nèi)的STX的檢出率高于其他品種，說明毛蚶蓄積高毒力毒素STX的能力較強(qiáng)。

分別從蝦夷扇貝、紫貽貝、毛蚶三種樣品中選取8、7、11個(gè)檢出種類較多且含量較高批次，分析其毒素成分特征，結(jié)果顯示：

8個(gè)批次陽性蝦夷扇貝樣品中PSP毒力以膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX 3、GTX4為主（均檢出，平均占比87.1%）。4批次檢出石房蛤毒素STX（占比10.9%～38.1%），4批次樣品檢出脫甲酰基類毒素dcNEO（占比14.4%～35.4%），還有少量的C1、C2（<5%）。

7個(gè)批次的陽性紫貽貝樣品中PSP毒力以膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4為主（均檢出，平均占比81.5%）。有3批次樣品中含有STX（占比10.8%～32.5%），2批次樣品中檢出dcNEO（3.9%和10.4%），還有少量的C1、C2（<5%）。

11個(gè)批次陽性毛蚶的樣品PSP毒力以膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX 3、GTX4（均檢出，平均占比64.4%）與石房蛤毒素STX（8個(gè)批次檢出，平均占比30.9%）為主。5個(gè)批次檢出dcNEO（平均占比12.6%）;5個(gè)批次檢出dcGTX2（平均占比6.7%），還有10批次檢出少量的C1、C2（<5%）。

從毒力組成看，主要為膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4，其次是石房蛤毒素STX和脫甲酰基類毒素dcGTX2、dcNEO，N-磺酰胺甲?；惗舅谻1、C2的檢出率較高但其毒力較低。

2.4PSP的季節(jié)變化特征

從蝦夷扇貝、紫貽貝、毛蚶這3個(gè)品種中PSP毒力結(jié)果的季節(jié)變化可以看出 （圖1所示），夏季（7月）的PSP毒力最強(qiáng)，冬季的毒力最低。從季節(jié)變化來看為夏季>秋季>春季>冬季，此結(jié)果與部分人的研究并不完全一致[7-8]。可能由于PSP為貝類從產(chǎn)毒藻類中獲得的外源性毒素，不同海域環(huán)境溫度等差別較大。本文所檢測的貝類產(chǎn)地均為渤海海域，黃世玉等[9]研究了溫度對產(chǎn)毒藻的生長影響，發(fā)現(xiàn)其最適宜溫度為22 ℃。而渤海海域近岸7月表層水溫為18.4～26.6 ℃[10]，為產(chǎn)毒藻適宜生長溫度，與本文結(jié)果相符。并且PSP受赤潮等突發(fā)事件影響較大，并不一定遵循規(guī)律性。

2.5PSP在貝類體內(nèi)的分布特征

為了解貝類中不同部位的毒素含量，將檢PSP的紫貽貝、蝦夷扇貝、毛蚶樣品去殼后，將部分樣品中的消化腺分離出來，分別測定消化腺和其它貝肉中PSP含量。結(jié)果顯示，紫貽貝、蝦夷扇貝、毛蚶消化腺中的PSP含量較高，其它貝肉組織中PSP含量較低或未檢出，貝類體內(nèi)的PSP主要分布于消化腺內(nèi)。

2.6樣品的超標(biāo)情況

目前，絕大多數(shù)國家與歐盟將80 μg STXeq/100 g定為PSP的限量標(biāo)準(zhǔn)，方法為小鼠生物法和高效液相色譜法[11]。我國的《貝類生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督管理暫行規(guī)定》中規(guī)定麻痹性貝類毒素（PSP）總含量低于800 μg/kg。因此本文將800 μg STXeq/kg作為安全限量標(biāo)準(zhǔn)。

從本次檢測的最高檢出濃度來看，蝦夷扇貝為220.8 μg/kg、紫貽貝為288.5 μg/kg、毛蚶為180.9 μg/kg。對比800 μg STXeq/kg的標(biāo)準(zhǔn)，9種貝類全年的麻痹性貝毒含量均在安全食用范圍內(nèi)，可安全食用，不會對健康產(chǎn)生影響。但對最高檢出濃度的紫貽貝樣品消化腺進(jìn)行單獨(dú)檢測，結(jié)果顯示PSP檢測值為728.3 μg/kg，遠(yuǎn)高于全貝組織的檢測值，接近 800 μg/kg的安全食用標(biāo)準(zhǔn)。為了安全起見，食用貝類時(shí)可先去除消化腺，能夠有效地防止PSP中毒風(fēng)險(xiǎn)。

3總結(jié)

所檢測的9種主要經(jīng)濟(jì)貝類PSP毒力當(dāng)量均低于安全限量，天津市售主要經(jīng)濟(jì)貝類均可安全食用。從季節(jié)變化來看，夏秋季貝類體內(nèi)PSP含量較高，應(yīng)加強(qiáng)注意。PSP主要存在于貝類的消化腺內(nèi)，為安全起見可去除消化腺后再食用貝類。13種PSP毒素除GTX1外主要檢出毒素為中、低毒力毒素，毛蚶對STX毒素的蓄積能力高于其它貝類。

目前天津市售主要經(jīng)濟(jì)貝類主要產(chǎn)地均為渤海海域，渤海海域富營養(yǎng)化程度整體較高，赤潮現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此PSP超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)依然存在。有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)PSP監(jiān)測，提高監(jiān)測頻率和覆蓋范圍，監(jiān)測貝類產(chǎn)品的同時(shí)監(jiān)測產(chǎn)毒藻類。建立完整的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警體系及管理控制措施，監(jiān)測到有貝類產(chǎn)品超標(biāo)、養(yǎng)殖海域發(fā)生赤潮等突發(fā)災(zāi)害時(shí)，應(yīng)及時(shí)通知生產(chǎn)者和消費(fèi)者，更好地保證貝類的生產(chǎn)安全和消費(fèi)者的生命安全。

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Analysis of pollution status and composition characteristics of PSP

in main economic shellfish sold in Tianjin

SHI Wenbo，GAO Lina，HAN Xianqin，LI Chunqing，CHEN Yongping

（Tianjin Agricultural Ecological Environment Monitoring and Agricultural Product Quality Testing Center，Tianjin? 300221）

Abstract：Determination of 13 paralytic shellfish poisonings （PSP） in 9 commercial shellfish in Tianjin by LC-MS / MS，analyze the pollution status and composition characteristics of PSP.The results showed that PSP was detected in 6 species of shellfish.The detection rate of Mytilus edulis，Patinopecten yessoensis and Scapharca subcrenata was higher，which were 66.7%，58.3% and 58.3% respectively.The detection rates of N-sulfonamide formyl toxins C1，C2 and gonyan toxin GTX1，GTX2，GTX3 were high，gonyautoxin GTX1-4 were the main toxin in the virulence ratio.The content of STX in Scapharca subcrenata was significantly higher than that in other species.The seasonal variation of toxin content was the highest in summer and the lowest in winter.PSP mainly exists in the digestive gland of shellfish.The content of PSP in the whole year was within the safe range.

Key words：PSP; LC-MS/MS; pollution status; feature analysis

（收稿日期：2019-11-29）

基金項(xiàng)目：天津市水產(chǎn)局科研推廣項(xiàng)目J2017-08，天津主要經(jīng)濟(jì)貝類中貝類毒素現(xiàn)狀調(diào)查與分析。

作者簡介：時(shí)文博（1986.5-）男，工程師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：shiwb512@163.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2020.02.010