張順榮，李東芳，何寄琴，焦 蕉，唐繼云，李玉明，何 欣，周 珉，吳 鴻

(1. 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201； 2. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，長沙 410013；3. 長沙市第八醫(yī)院腫瘤科，長沙 410100； 4. 衡陽市中醫(yī)院，湖南 衡陽 421000)

我國胃癌的發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1]。據(jù)國家癌癥研究機(jī)構(gòu)報(bào)告，2012 年中國胃癌發(fā)病率和死亡率分別位于全球第5、6位，發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6% 和45.0%[2]。胃癌目前的治療現(xiàn)狀雖取得一定進(jìn)展，但對于中晚期胃癌總體療效仍不容樂觀，因此開發(fā)新藥及探索多學(xué)科治療模式成為必然。中醫(yī)藥在中晚期胃癌治療中協(xié)同放化療增效減毒或通過扶正祛邪，改善癥狀，延長患者生存期，成為一種重要的替補(bǔ)治療。

胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，涉及多因素、多步驟、多基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖和無序凋亡，其中細(xì)胞惡性增殖是腫瘤發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)，因此有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是研究抗腫瘤藥物的關(guān)鍵。胃復(fù)方是臨床治療胃癌的經(jīng)驗(yàn)方，通過前期研究發(fā)現(xiàn)，胃復(fù)方抑制裸鼠移植瘤的生長與下調(diào)垂體瘤轉(zhuǎn)化基(pituitary tumor transforming gene,PTTG)、骨髓細(xì)胞瘤病毒(cellular-myelocytomatosis viral oncogene, c-Myc)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)其作用機(jī)制設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，觀察胃復(fù)方含藥血漿對人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖及PTTG相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響，為胃復(fù)方治療胃癌提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)開展獲得中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬腫瘤醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 SD SPF級大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄各半，購自湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司(使用許可證號SYXK(湘)2014—0016，生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2011-0003)。人胃癌BGC-823細(xì)胞株購自武漢博士德公司，用含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L的RPMI-1640培養(yǎng)基，于飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物與試劑 氟尿嘧啶注射液(10 ml 0.25 g，產(chǎn)品批號FA150611)，上海旭東海普。1640培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(FBS)(Gibco)、胰酶消化液(碧云天)、DMSO(國藥集團(tuán))、MTT試劑盒(美國Sigma公司)、細(xì)胞周期試劑盒(凱基生物)、Trizon Reagent、超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA、UltraSYBR Mixture(CWBIO 康為世紀(jì))。

1.1.3 主要設(shè)備與儀器 臺式冷凍離心機(jī)(中國深圳黑馬)、多功能酶標(biāo)分析儀(匯松)、恒溫培養(yǎng)箱(光明)、超凈工作臺(北京亞泰隆)、倒置顯微鏡(北京中顯恒業(yè)儀器)、正置熒光顯微鏡(Motic)、熒光PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.1.4 中藥混懸液 胃復(fù)方組成：黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、香附、郁金、蘇木、莪術(shù)、蚤休、半枝蓮、女貞子、菟絲子、白花蛇舌草、甘草、雞內(nèi)金、炒麥芽、炒谷芽共200 g。所有生藥購自湖南省腫瘤醫(yī)院中藥房，并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教研室鑒定，常規(guī)水煎水浴濃縮至生藥含藥量0.6 g/ml，灌裝滅菌置于4 ℃冰箱中備用。

1.1.5 含藥血漿的制備 將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，分別為空白對照組、胃復(fù)方高劑量組1.8 g/ml(相當(dāng)于人臨床用藥量的4倍)、中劑量組0.9 g/ml(相當(dāng)于人臨床用藥量的2倍)、低劑量組0.45 g/ml(相當(dāng)于人臨床用藥量)、5-Fu陽性對照組各6只。中藥組灌胃每次2 ml，每日2次(9 am，4 pm)，連續(xù)7 d?？瞻讓φ战M灌服等量生理鹽水，西藥對照組每日按4 mg/200 g 5-Fu腹腔注射，隔日1次，連續(xù)4次。各組末次給藥后2 h，用5%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈采血，同組大鼠的血液混勻后合裝于肝素抗凝管，經(jīng)3000 r/min離心，10 min后收集血漿，0.22 μm濾膜過濾，56 ℃水浴滅活30 min，分裝置-20 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測含藥血漿對人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖 取活力大于95%的對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組6孔，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL，用無血漿RPMI-1640培養(yǎng)24 h使細(xì)胞生長為G0期。用各組含藥血漿培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h后更換培養(yǎng)液，每孔加入MTT(5.0 mg/mL)溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心、吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，待結(jié)晶物充分溶解后，采用酶標(biāo)儀測定490 nm 處(630 nm 為參照波長)的吸光度(OD)值，分別計(jì)算每組平均抑制率(IR)。抑制率=(空白血清對照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白血清對照組OD 值×100%，并繪制細(xì)胞抑制率曲線。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測人胃癌BGC-823細(xì)胞周期 將細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)成濃度1×106/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分為空白血漿組、5-Fu對照組、胃復(fù)方低、中、高劑量組，每組3個(gè)復(fù)孔，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，空白組和5-Fu組分別加入空白血漿和5-Fu含藥血漿，其余3組分別加入胃復(fù)方低、中、高劑量含藥血漿，分別刺激72 h 后，胰酶消化收集細(xì)胞。用400 μlPBS使細(xì)胞分離，調(diào)整加入預(yù)冷的乙醇濃度為75%，低溫過夜固定。取出固定樣品離心棄上清，重復(fù)1～2次去乙醇，加入150 μl PI(典化丙啶)工作液，4 ℃避光染色30 min。染色完成后24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀在固定波長處檢測熒光強(qiáng)度及散射情況。

1.2.3 熒光定量法檢測PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA表達(dá) 表1顯示，細(xì)胞以1×106/ml密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，空白組加入無含藥血漿，5-Fu對照組及胃復(fù)方組低、中、高劑量組加入相應(yīng)濃度的含藥血漿；在加入藥物的72 h后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，在260 nm和280 nm處測定OD值，計(jì)算濃度及純度；M-MLV法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用SYBR法在qPCR儀上檢測PTTG、C-Myc及hTERT基因表達(dá)水平；以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測PTTG、c-Myc、hTERT蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同上1.2.3；收集藥物處理72 h后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，按照BCA蛋白定量測定蛋白濃度，按照比例加入蛋白緩沖液煮沸5 min分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將配置好?%的濃縮膠加入10%的分離膠，然后將梳子插入，室溫下待膠凝固；然后取相同含量的各蛋白樣品，分別與裂解液混勻，煮沸5 min置于冰盒中速冷；加樣：第一孔點(diǎn)入彩色染料maker，余每孔加已變性的蛋白開始電泳。電泳后開始轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗室溫孵育、二抗室溫孵育，將ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo)與膜孵育3 min，混合反應(yīng)后約1 min，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光。分別檢測PTTG、c-Myc、hTERT蛋白表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃復(fù)方含藥血漿抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖活性

表2圖1顯示，與空白對照組比較，5-Fu對照組和胃復(fù)方低、中、高劑量各組在分別刺激胃癌BGC-823 細(xì)胞24 h、48 h、72 h后的OD 值均降低，中藥組按濃度從低至高的順序，其OD值依次降低并與刺激時(shí)長呈負(fù)相關(guān)。其中72 h時(shí)段，各組OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)取72 h，抑制率(IR)依次升高并與刺激時(shí)長呈正相關(guān)。其中72 h內(nèi)不同濃度含藥血漿隨著時(shí)間延長抑制率逐漸增強(qiáng)，但到72 h及之后強(qiáng)度呈下降趨勢。

表2 胃復(fù)方含藥血漿對人胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖的抑制作用

注：含藥血漿培養(yǎng)人胃癌BGC-823細(xì)胞同一時(shí)段OD值比較：與空白血漿組比較:*P<0.05；與胃復(fù)方低劑量組比較:&P<0.05；與胃復(fù)方中劑量組比較:☆P<0.05；與5-Fu組比較:#P<0.05

圖2 胃復(fù)方含藥血漿對人胃癌BGC-823細(xì)胞周期影響比較

圖1 胃復(fù)方含藥血漿對人胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 胃復(fù)方含藥血漿對人胃癌BGC-823細(xì)胞周期的影響

表3圖2顯示，與空白對照組比較，5-Fu對照組和胃復(fù)方低、中、高劑量組分別作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞72 h后，其G0/G1期細(xì)胞比率增加(P<0.05)，S期和G2/M 期均減少(P<0.05)，其中G0/G1期細(xì)胞比率隨著胃復(fù)方濃度提高而增加，與胃復(fù)方濃度呈正相關(guān)，S期和G2/M 期隨著胃復(fù)方濃度的提高而減少，與胃復(fù)方濃度呈負(fù)相關(guān)。

表3 胃復(fù)方含藥血漿對人胃癌BGC-823細(xì)胞周期影響比較

注：與空白組比較:*P<0.05；與5-FU組比較比較:#P<0.05；與復(fù)方低劑量組比較:&P<0.05；與復(fù)方中劑量組比較:☆P<0.05

2.3 人胃癌BGC-823細(xì)胞中PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果

表4圖3顯示，與空白對照組比較，藥物組均能下調(diào)PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)，隨著中藥劑量的升高而下調(diào)效果更明顯，呈劑量依賴性。與胃復(fù)方低、中劑量組比較，胃復(fù)方高劑量組、5-Fu組明顯下調(diào)PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)量(P<0.05)。Western biot法對各組細(xì)胞進(jìn)行檢測蛋白表達(dá)條帶。

表4 藥物組對人胃癌BGC-823細(xì)胞PTTG、C-myc、hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)影響比較

注：與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01；與胃復(fù)方低劑量組比較:△P<0.05；與胃復(fù)方中劑量組比較:▉P<0.05

圖3 藥物組對人胃癌BGC-823細(xì)胞中PTTG、C-myc、hTERT蛋白表達(dá)的影響

3 討論

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因(pitui tary tumor-transfo rming gene，PTTG)是一種腫瘤轉(zhuǎn)化基因，其突變可以影響腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡進(jìn)程[3-4]。原癌基因(c-Myc)是一種與細(xì)胞周期密切的核癌基因，它是PTTG下游靶基因，影響細(xì)胞生長、增殖、分化，與人類許多腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)歸相關(guān)[5-6]。近年來，相繼在多種腫瘤中檢測到c-Myc高表達(dá), 同時(shí)常伴隨其調(diào)控上游蛋白PTTG異常表達(dá)。有學(xué)者提出：“c-Myc-hTERT-細(xì)胞無限增殖化”學(xué)說，因此基于“PTTG-c-Myc-hTERT-細(xì)胞增殖”途徑，探索中醫(yī)藥治療胃癌的可能作用機(jī)制，為中醫(yī)藥研究提供新思路。

胃復(fù)方是湖南省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要功效為健脾益氣、化瘀解毒，經(jīng)過30余年的臨床實(shí)踐，對胃癌患者具有較好的臨床療效[7-8]。課題組前期研究證實(shí)，胃復(fù)方含藥血漿能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)也能夠抑制裸鼠移植瘤的生長[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法進(jìn)一步證實(shí)，胃復(fù)方不同濃度含藥血漿有效抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖，并呈劑量及時(shí)間依賴性。同時(shí)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)其可以阻滯BGC-823細(xì)胞由G0/G1 期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞生長。這與國內(nèi)針對其中某些單藥提取物的研究結(jié)果相仿。如[11-13]黃芪提取物黃芪多糖、蚤休提取物總皂苷、白術(shù)水提取物能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。吉愛軍等[14]發(fā)現(xiàn)，三棱、莪術(shù)的水提取物能夠阻止細(xì)胞無限制從G1 期進(jìn)入S期，產(chǎn)生細(xì)胞增殖抑制及促進(jìn)凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[15]，溫莪術(shù)大小劑量、廣莪術(shù)大中劑量及蓬莪術(shù)中劑量含藥血清在加藥后48 h 都能抑制胃癌BGC823的細(xì)胞增殖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，胃復(fù)方含藥血漿作用細(xì)胞后可下調(diào)PTTG、C-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)水平?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，本研究中所用藥材含有效成分，如黃酮類化合物、黨參多糖、半枝蓮多糖、白花蛇舌草多糖、重樓皂苷、莪術(shù)提取物欖香烯、莪術(shù)醇等均對多種癌細(xì)胞有抑制作用[16-21]，這些有效成分可能構(gòu)成抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，胃復(fù)方含藥血漿可能下調(diào)PTTG、c-Myc、hTERT mRNA和蛋白表達(dá)來抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，為臨床提供重要的理論依據(jù)，其機(jī)制值得深入研究。