李 思，張智龍，楊元慶，周星婭，薛 莉，王 栩，邢曉彤

(天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,天津 300120)

糖尿病前期是指血糖水平介于正常值與糖尿病診斷標準之間的一種糖代謝異常狀態(tài)，此期是2型糖尿病的高危易患人群，也是導(dǎo)致心腦血管事件的主要危險因素之一，并且較多糖尿病前期患者易合并大血管、微血管病變，或合并肥胖、高血脂、高血壓等其他代謝紊亂問題。在2010年的1項對98658名中國成年人的調(diào)查顯示，約有50.1%的成年人處于糖尿病前期階段[1]。而超重和肥胖亦是2型糖尿病的危險因素之一，有80%的2型糖尿病前期患者發(fā)病時僅存在肥胖，無其他明顯癥狀[2]。而對該人群進行早期干預(yù)，可使2型糖尿病發(fā)病危險降低58%[3-4]。

課題組通過多年的臨床實踐總結(jié)出的“調(diào)理脾胃針法”，在治療2型糖尿病方面有著較好的療效。前期研究顯示，針刺可改善2型糖尿病大鼠的糖代謝及胰島素敏感性[5]，但對2型糖尿病前期的降糖療效尚不明確。因此為提高慢性病防治效果，本研究以高糖高脂飼料誘導(dǎo)2型糖尿病前期肥胖大鼠模型，以調(diào)理脾胃針法為干預(yù)措施，探討針刺的降糖作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供的健康雄性5～6周SPF級Wistar大鼠(動物許可證號SCXK—<軍>2012-0004)40只，體質(zhì)量160～180 g。動物房室溫保持在(25±2)℃，相對濕度保持在(55±5)%，實驗動物在實驗期間自由獲取食物和飲用水，實驗過程中對動物飼養(yǎng)及處理遵循2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[6]。

1.1.2 飼料配方 普通飼料及高脂高糖飼料均由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心加工提供。高脂高糖飼料配方：原料包括普通飼料63.9%,蔗糖20%,豬油10%,蛋黃粉5%,膽固醇1%,豬膽汁酸鈉0.1%,所有動物飼料保存于專用冰箱，4 ℃保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 大鼠胰島素(INS)ELLSA Kit(武漢華美生物公司，貨號CSB-E05070r)；血糖試紙(美國雅培公司)；血糖儀(美國雅培公司)；電子稱(深圳Meilen公司)；精密天平(日本YMC公司)；臺式PH計(瑞士METTLER TOLEDO公司)；TDZ4-WS低速臺式離心機(長沙湘儀公司)；溫育箱(上海天呈公司)；酶標儀(美國BioTeK儀器公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 2型糖尿病前期大鼠模型制備方法 高糖高脂飼料飼養(yǎng)誘導(dǎo)動物模型復(fù)制方法[7]：健康雄性SPF級Wistar大鼠40只，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機抽取10只大鼠作為正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。實驗組30只用于造模，給予高糖高脂飼料，投食量不限，所有大鼠自由飲水。每周稱體質(zhì)量、量身長、測肥胖指數(shù)，連續(xù)飼養(yǎng)12周。挑選體質(zhì)量超出正常對照組20%的大鼠作為模型復(fù)制成功的大鼠。于成模后將造模組按隨機數(shù)字表法分為針刺組、模型組、西藥組各10只。正常對照組給予普通飼料，其余各組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 動物分組干預(yù)方法 針刺組采用“調(diào)理脾胃針法”進行針刺，取穴曲池、合谷、血海、足三里、豐隆、陰陵泉、地機、三陰交、太沖(以上穴位均取雙側(cè))、中脘，具體腧穴定位參照林文注主編的《實驗針灸學(xué)》[8]。

圖1、2示，操作方法：將大鼠置于前期研究中自制的大鼠針刺服中[5]，以減少躁動。身著大鼠針刺服后，大鼠躁動基本消失，可同時多針刺、久留針及同時針刺腹部與四肢腧穴，并可多只同時行針刺操作，具有針刺可行性。而后穴位與針具常規(guī)消毒，選用中研太和0.25×25 mm針灸針進行針刺，每次留針30 min，不做手法，每日1次，連續(xù)針刺30 d。模型組采取同樣方法抓取、穿衣，但不進行任何治療?？瞻捉M不做任何干預(yù)。

圖1 大鼠針刺服

圖2 針刺示意圖

西藥組：鹽酸二甲雙胍片(格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格0.5 g/片，國藥準字H20023370)。參考文獻并結(jié)合臨床常用劑量，最終確定實驗劑量為250 mg/kg，使用時以5%阿拉伯樹膠水溶液配制成混懸液，濃度25 mg/ml。

1.2.3 造模前后一般情況觀察 觀察造模前后各組大鼠精神狀態(tài)、毛色、進食量、飲水量、尿量、便質(zhì)，并記錄死亡情況。

1.2.4 體質(zhì)量、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(P2BG)的測量 測量前各組大鼠禁食12 h，自由飲水。于干預(yù)前、針刺30 d末次治療結(jié)束后用電子稱稱量體質(zhì)量，而后采用尾靜脈取血方式，用血糖儀測量FBG。其后根據(jù)動物體質(zhì)量用40%葡萄糖溶液，按照2 g/kg的劑量[9]給予大鼠灌胃，并于灌胃后120 min采取尾靜脈取血方式，用血糖儀測量P2BG。

1.2.5 空腹血清胰島素(FINS)測量 測量前各組大鼠禁食12 h，自由飲水。于干預(yù)前、針刺30 d末次治療結(jié)束后用乙醚麻醉，采用眼眶靜脈竇采血法，取約2 ml血液，靜置20 min后于4 ℃ 3000×g離心15 min，取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附測定法，應(yīng)用大鼠胰島素(INS)ELISA Kit測量FINS。

1.2.6 胰島素敏感指數(shù)(ISI)測量 胰島素敏感指數(shù)計算[9]：采用公式ISI=Ln(l/FINS×FBG)，其中(FINS：空腹血清胰島素；FPG：空腹血糖)計算胰島素敏感指數(shù)。

1.2.7 血脂、游離脂肪酸 (FFA) 提取血清，按試劑盒說明書要求測定TC、TU、LDL-C、HDL-C含量；采用放免法測定，試劑盒由上海生物制品研究所提供，游離脂肪酸 (FFA)測定試劑盒。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

造模前各組大鼠反應(yīng)靈敏，毛色光澤，體型健壯，便質(zhì)質(zhì)軟成形。造模組大鼠造模后慵懶少動，毛色晦暗，體形肥胖，進食量、飲水量、尿量明顯增多，便質(zhì)溏稀。

2.2 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量、血糖及胰島素抵抗相關(guān)指標比較

表1顯示，干預(yù)前組間經(jīng)方差分析比較，成模后針刺組、西藥組、模型組體質(zhì)量、血糖及胰島素抵抗相關(guān)指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與空白組比較體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)，F(xiàn)BG、P2BG、FINS、ISI明顯增高(P<0.01)。干預(yù)后，模型組與空白組比較，體質(zhì)量下降(P<0.05)，F(xiàn)BG、P2BG、FINS、ISI明顯增高(P<0.01)。針刺組、西藥組與模型組比較，體質(zhì)量明顯升高，F(xiàn)BG、P2BG、FINS、ISI明顯下降(P<0.01)。針刺組與西藥組各指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；組內(nèi)比較，針刺組、西藥組體質(zhì)量較干預(yù)前明顯增加(P<0.01)，模型組體質(zhì)量較干預(yù)前明顯減輕(P<0.01)。針刺組、西藥組FBG、P2BG、FINS、ISI較前明顯降低(P<0.01)，模型組FBG較前升高(P<0.05)，P2BG、FINS、ISI較前未見變化(P>0.05)，提示針刺治療能有效改善糖尿病前期肥胖大鼠的FBG、P2BG、FINS、ISI，控制體質(zhì)量，療效與西藥組相當(dāng)。

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量、血糖及胰島素抵抗相關(guān)指標比較

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較:∧∧P<0.01；與治療前比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.3 干預(yù)后各組大鼠血脂及FFA比較

表2顯示，干預(yù)后與空白組比較，模型組TC、TG、LDL-C、FFA水平均顯著升高，HDL-C顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)FA變化不顯著(P>0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠TC、TG、LDL-C、FFA水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高 (P<0.01)。而西藥組上述指標亦較前明顯改善，與針刺組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示針刺組改善糖尿病前期肥胖大鼠血脂及FFA水平，療效與西藥相當(dāng)。

表2 干預(yù)后各組大鼠血脂及FFA變化比較

注：與空白組比較:**P<0.01；與模型組比較:△△P<0.01；與針刺組比較:▲▲P<0.01

3 討論

美國糖尿病協(xié)會(american diabetes association，ADA)指出，糖尿病前期為血糖超過正常值，但尚未達到糖尿病診斷標準，包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)和葡萄糖耐量減退(impaired glucose tolerance，IGT)。其反映基礎(chǔ)狀態(tài)下及糖負荷后的血糖調(diào)節(jié)功能，并將二者合稱為葡萄糖調(diào)節(jié)受損(impared glucose regulation，IGR)[10-11]。2013年中國糖尿病防治指南[4]亦指出，糖尿病前期表現(xiàn)為IFG和IGT，是由健康狀態(tài)進展為糖尿病的一個特殊階段。臨床研究證實[12]，糖尿病前期患者就開始存在胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、脂代謝紊亂等危險因素。為延緩這一過程，關(guān)鍵在于早期的積極干預(yù)，加強對此類人群的監(jiān)測及管理，從而逆轉(zhuǎn)IGR狀態(tài)，減少糖尿病的發(fā)生。

課題組通過以長期高脂高糖飲食復(fù)制2型糖尿病前期肥胖大鼠模型，成模后的大鼠表現(xiàn)出慵懶少動，毛色晦暗，體形肥胖，進食量、飲水量、尿量明顯增多、便質(zhì)溏稀等癥狀。以上癥狀的出現(xiàn)，或可佐證課題組提出的“脾胃升降運化失常”是演變?yōu)橄实牟C關(guān)鍵。因脾胃同居中焦，水谷精微皆賴于脾胃升降運化。若久食肥甘，脾胃運化失常，膏脂留于肌腠則體胖；脾不散精上輸于肺，肺無以輸布則出現(xiàn)口渴多飲、體倦、毛發(fā)無光；脾不能為胃行其津，燥熱內(nèi)盛，出現(xiàn)消谷善饑；脾不能轉(zhuǎn)輸水谷精微，使其下流膀胱，出現(xiàn)尿多而甘。調(diào)理脾胃針法穴取曲池調(diào)胃腸氣機，合谷升而能散,與曲池相伍通降腸胃,蕩滌一切邪穢；中脘升清降濁，足三里健脾胃、助運化；陰陵泉健脾化濕，三陰交健脾益氣、調(diào)和氣血,與陰陵泉相伍健脾利濕；太沖平肝調(diào)肝；豐隆祛濕化痰；血海引血歸脾、活血理血；地機善于活血化瘀，諸穴合用使升降有序、健運有常、氣血得化、精微得布,臟腑百骸得以濡養(yǎng)。

本實驗中由于飼喂高脂高糖飼料的緣故，導(dǎo)致造模的各組大鼠體質(zhì)量、FBG、P2BG、FINS、ISI較空白組明顯增高，提示模型組存在明顯的IR，造模成功。分組干預(yù)30 d后，針刺組大鼠FBG、P2BG較模型組及干預(yù)前明顯下降，且FINS水平與ISI均得到改善，提示針刺降糖是通過改善外周組織的IR實現(xiàn)的。而前期的實驗研究顯示，針刺可通過改善PI3K信號通路上下游關(guān)鍵蛋白IRS-1、IRS-2、GLUT-4，從而減輕IR，同時PI3K又為胰島素信號傳導(dǎo)的主要通路[13-15]。因此，筆者推論針刺可能通過PI3K通路促進胰島素信號的下傳，從而將葡萄糖更多地轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，進而引起FBG、P2BG下降。又因胰島素信號通路的改善，使FINS含量下降、INS降低。

與模型組比較，干預(yù)后針刺組大鼠TC、TG、LDL-C、FFA水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高。FFA的代謝正常與否在2型糖尿病的發(fā)病過程中起非常重要的作用。FFA 水平增高既可增加IR，又可引起高胰島素血癥[16]。FFA通過葡萄糖-脂肪酸循環(huán)影響糖代謝，隨著FFA濃度升高，脂肪酸氧化逐漸增加，抑制葡萄糖氧化和糖酵解，促使丙酮酸羧化酶活性增高，促進糖異生，使糖在細胞內(nèi)堆積，從而抑制肌肉、肝臟等組織對葡萄糖的攝取和利用；同時可引起肝細胞對胰島素的敏感性降低，使肝臟葡萄糖輸出增多，血糖水平升高[17]，故本研究亦提示針刺可改善脂代謝及FFA水平。

因此本研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)理脾胃針法能有效調(diào)節(jié)2型糖尿病前期大鼠的糖脂及胰島素水平，增強其胰島素的敏感性，降低血清中FFA水平，緩解 FFA 對外周葡萄糖利用的抑制作用，減輕胰島素抵抗，從而為今后進一步的臨床研究提供實驗依據(jù)。