任培中，苗 青，楊 斌，范藝齡，樊茂蓉，3△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091； 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100016)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一種以進(jìn)行性肺功能損害及呼吸困難加重為特征的慢性致死性疾病[1]，對人類健康危害極大且缺乏理想的治療手段，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積是IPF的主要病理改變之一[2]。相關(guān)研究表明[3]，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)系統(tǒng)的失衡可能會導(dǎo)致其異常沉積。因此，調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs平衡可能具有抑制ECM過度沉積的作用。本研究通過建立肺纖維化大鼠模型，觀察通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方對模型大鼠肺功能、MMP9/TIMP1平衡以及纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原(Type IV Collagen，Col Ⅳ)表達(dá)水平的影響，探討通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方治療IPF的部分分子生物學(xué)機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量(120±10)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(許可證編號 SCXK(京)2014-0004)，常規(guī)飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級動物房，12 h光照和夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方藥物組成：生黃芪60 g,升麻6 g,旋覆花15 g,威靈仙12 g,海浮石15 g,三棱10 g,莪術(shù)10 g,甘草6 g，均由河北神農(nóng)北京藥業(yè)有限公司提供，每劑藥由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院煎藥室制備為100 mL濃縮液；乙酰半胱氨酸泡騰片(海南贊邦制藥有限公司，批號H20140449)。

1.3 主要儀器和試劑

博來霉素(美國Invitrogen，批號r25001-8)；FN抗體、Col Ⅳ抗體、MMP9抗體和TIMP1抗體(美國Abcam，批號分別為ab2413，ab6586，ab58803，ab38978)；即用型免疫組化試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號KIT-9701)；動物肺功能分析系統(tǒng)和動物呼吸機(jī)(北京貝蘭博科技有限公司，型號分別為AniRes2005，RES3020)；生物組織包埋機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號YD-6 L)；石蠟切片機(jī)(美國Thermo，型號Finesse325)；自動化智能型正置研究級顯微鏡(Olympus，型號BX40)；電泳儀電源和電泳槽(美國BIO-RAD，型號分別為PowerPacTM1645050，Mini-PROTEAN Tetra System 1658000)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Azure Biosystems，型號C600)。

2 方法

2.1 分組及造模給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥初期干預(yù)組、中藥中期干預(yù)組、中藥后期干預(yù)組、西藥初期干預(yù)組、西藥中期干預(yù)組和西藥后期干預(yù)組，參考文獻(xiàn)復(fù)制肺纖維化大鼠模型[4]。中藥初、中、后干預(yù)組分別自造模后第3、14、28天起給予通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方14.07 mg·kg-1·d劑量灌胃，給藥90 d；西藥初、中、后期干預(yù)組分別自造模后第3、14、28天起給予N-乙酰半胱氨酸150 mg·kg-1·d劑量灌胃，給藥90 d；模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠給藥劑量按照人與大鼠體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)0.018及成人常規(guī)服用劑量換算[5]，給藥體積為10 mL·kg-1。

2.2 肺功能檢測及取材

實(shí)驗(yàn)第19周分別于各組大鼠中隨機(jī)選擇9只進(jìn)行肺功能檢測及取材。以1%戊巴比妥鈉溶液(60 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，約5 min后行氣管插管，將大鼠仰臥放入體描箱，連接氣管插管與體描箱氣路，F(xiàn)VC檢測壓力參數(shù)設(shè)定30cmH2O，待數(shù)據(jù)曲線穩(wěn)定后開始采集，經(jīng)軟件處理后計算出所需肺功能各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值，包括用力肺活量(FVC)、0.3 s內(nèi)平均流速(FEVO.3/FVC%)、呼氣峰流速(PEF)、最大通氣量(MVV)和動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)。肺功能檢測后處死大鼠，無菌、低溫條件下提取肺組織，右肺中葉上半部分置于10%中性福爾馬林固定液中固定，右肺中葉下半部分置于凍存管中，液氮冷凍后置-80 ℃冰箱保存。

2.3 免疫組化檢測

采用免疫組化法檢測大鼠肺組織中FN和Col Ⅳ的表達(dá)部位及表達(dá)水平。取切片脫蠟至水，枸櫞酸溶液中加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，依次滴加試劑A(過氧化氫阻斷劑)室溫孵育，試劑B(動物非免疫血清)室溫孵育，一抗4 ℃孵育過夜，試劑C(生物素標(biāo)記的羊抗兔)室溫孵育，試劑D(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶)室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染30 s，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。于光鏡下拍攝圖像,將采集的圖像應(yīng)用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析,以免疫組織化學(xué)染色陽性信號累積光密度(IOD)值做半定量分析。

2.4 Western Blotting檢測

采用Western Blotting法檢測大鼠肺組織中MMP9和TIMP1的表達(dá)水平。取適量凍存肺組織提取全蛋白并進(jìn)行蛋白定量；常規(guī)制備SDS-PAGE膠，取樣品進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，待轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜轉(zhuǎn)移至平皿，加入封閉液(含5%奶粉的TBST)置于搖床上室溫封閉1 h，加一抗室溫輕搖孵育1 h后4 ℃孵育過夜；一抗孵育完畢，加入二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h；二抗孵育完畢，化學(xué)發(fā)光顯色，放入凝膠成像儀中顯影；應(yīng)用Quantity One軟件分析MMP9、TINP1及β-actin條帶灰度值，計算MMP9、TINP1與β-actin灰度值的比值作為其各自的相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方對肺纖維化大鼠肺功能的影響

表1顯示，模型組大鼠FVC和Cdyn水平與空白組比較顯著降低(P<0.01)，中西藥各干預(yù)組大鼠FVC水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中藥初期干預(yù)組和中藥中期干預(yù)組大鼠Cdyn水平較模型組顯著增高(P<0.05)；模型組大鼠FEV0.3/FVC、PEF及MVV水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),中西藥各干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方對大鼠肺功能相關(guān)指標(biāo)的影響

注：與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

3.2 通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方對肺纖維化大鼠肺組織中FN、Col Ⅳ表達(dá)的影響

圖1、2表2顯示，F(xiàn)N染色為棕黃色，主要集中在肺血管、支氣管周圍、肺泡間隔及增生的間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)；模型組大鼠FN表達(dá)水平較空白組顯著增高(P<0.01)，中西藥各干預(yù)組大鼠FN表達(dá)水平較模型組顯著降低(P<0.01)，中西藥各干預(yù)組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Col Ⅳ染色顯示為棕黃色，其顯色區(qū)域與FN顯色區(qū)域基本相同；模型組大鼠Col Ⅳ表達(dá)水平較空白組顯著增高(P<0.01)，中西藥各干預(yù)組大鼠Col Ⅳ表達(dá)水平較模型組顯著降低(P<0.05)，中西藥各干預(yù)組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：K. 空白組；M. 模型組；Z-3. 中藥初期干預(yù)組；Z-14. 中藥中期干預(yù)組；Z-28. 中藥后期干預(yù)組；X-3. 西藥初期干預(yù)組，X-14. 西藥中期干預(yù)組；X-28. 西藥后期干預(yù)組圖1 各組大鼠肺組織FN免疫組化結(jié)果(×200)

3.3 通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方對肺纖維化大鼠肺組織中MMP9/TIMP1表達(dá)的影響

表2圖3顯示，模型組大鼠MMP9表達(dá)水平較空白組顯著增高(P<0.01)，中藥初期干預(yù)組大鼠MMP9表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)，其余各組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中西藥各干預(yù)組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組大鼠TIMP1表達(dá)水平較空白組均顯著增高(P<0.05)，中西藥各干預(yù)組大鼠TIMP1表達(dá)水平較模型組顯著降低(P<0.05)，中西藥各干預(yù)組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：K.空白組；M.模型組；Z-3.中藥初期干預(yù)組；Z-14.中藥中期干預(yù)組；Z-28.中藥后期干預(yù)組；X-3.西藥初期干預(yù)組；X-14.西藥中期干預(yù)組；X-28.西藥后期干預(yù)組圖2 各組大鼠肺組織Col Ⅳ免疫組化結(jié)果(×200)

表2 通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方對大鼠肺組織中FN、Col Ⅳ蛋白IOD值及MMP9/TIMP1蛋白相對表達(dá)量影響比較

注：與空白組比較:**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05;與模型組比較:##P<0.01

注：K. 空白組；M. 模型組；Z-3. 中藥初期干預(yù)組；Z-14. 中藥中期干預(yù)組；Z-28. 中藥后期干預(yù)組；X-3. 西藥初期干預(yù)組；X-14. 西藥中期干預(yù)組；X-28. 西藥后期干預(yù)組圖3 各組大鼠肺組織MMP9、TIMP1 western blotting條帶圖

4 討論

IPF屬于中醫(yī)學(xué)“肺痹”“肺痿”“喘證”等范疇，多因氣虛而起，在此基礎(chǔ)上痰瘀等病理產(chǎn)物相繼出現(xiàn)，伏于肺絡(luò)，日久則氣、痰、瘀三者交互影響，正氣愈虛而邪氣愈盛，導(dǎo)致本病纏綿難愈[6-7]。通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方是臨床治療IPF的有效方劑，具有益氣升陷、疏通肺絡(luò)、化痰活血的功效。相關(guān)研究證實(shí)[8]，其治療IPF療效顯著，可提高患者的活動耐力及生活質(zhì)量，穩(wěn)定患者肺功能。

肺功能進(jìn)行性損害是IPF的重要臨床特征，其損害程度與患者死亡率具有明顯的相關(guān)性[9]，故穩(wěn)定患者肺功能在IPF的治療中具有重要意義。研究表明[10]，ECM的過度沉積與IPF肺功能進(jìn)行性下降存在密切相關(guān)性。生理狀態(tài)下的ECM沉積是對機(jī)體損傷的修復(fù)反應(yīng)，而這種修復(fù)反應(yīng)時間過長或修復(fù)過度時則成為致病性纖維化，增厚的ECM會阻礙組織功能，并可能導(dǎo)致器官衰竭[11]。FN和Col Ⅳ是ECM的重要組成部分，其異常表達(dá)是ECM過度沉積的具體體現(xiàn)。FN在博來霉素所致肺損傷的早期炎癥階段即開始出現(xiàn)聚集，表達(dá)量逐漸增加，其異常沉積貫穿肺纖維化發(fā)生發(fā)展的全過程[12]。Col Ⅳ是基底膜的重要組成部分，在IPF發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)異常沉積導(dǎo)致間質(zhì)增厚。本研究中，模型組大鼠肺功能FVC和Cdyn數(shù)值較空白組均出現(xiàn)下降，中藥初期和中期干預(yù)組大鼠Cdyn水平高于模型組，中藥各干預(yù)組大鼠FN、Col Ⅳ的蛋白染色區(qū)域明顯小于模型組，蛋白表達(dá)量明顯低于模型組，表明通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方可通過減少FN、Col Ⅳ等ECM的過度沉積起到改善大鼠肺功能的作用。

ECM過度沉積是IPF的特征性病理改變，其成因與肺組織中MMPs/TIMPs表達(dá)失衡密切相關(guān)。MMPs主要功能為降解ECM，但其活性可被TIMPs抑制，過量的TIMPs抑制MMPs不利于ECM的降解，容易導(dǎo)致肺泡間質(zhì)中ECM的過度沉積，促使肺纖維化的發(fā)生[3]。MMP-9屬于基膜型MMP, 其活性可被TIMP-1抑制。有研究證實(shí)[13-14]，在肺纖維化的動物模型中，MMP-9 和TIMP-1 的蛋白表達(dá)均明顯增高，且MMP9/TIMP1始終處于一種動態(tài)失衡狀態(tài)。在本研究中，模型組MMP9和TIMP1的表達(dá)量較空白組均有增加，且MMP9和TIMP1的增幅明顯不同呈失衡狀態(tài)，與文獻(xiàn)報道一致。此外本研究發(fā)現(xiàn)，中藥初期干預(yù)組大鼠MMP9和TIMP1表達(dá)水平均低于模型組，中藥中期和后期干預(yù)組大鼠MMP9表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但TIMP1表達(dá)水平均明顯低于模型組，中藥各干預(yù)組大鼠FN、Col Ⅳ的蛋白表達(dá)量明顯低于模型組，表明通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方可抑制MMP9和TIMP1表達(dá)量的異常升高，且能調(diào)控MMP9/TIMP1平衡來增強(qiáng)MMP9活性，進(jìn)而起到減少FN、Col Ⅳ等ECM過度沉積的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方可抑制大鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，改善肺纖維化大鼠肺功能，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MMP9/TIMP1平衡以增強(qiáng)MMP9活性，進(jìn)而減少FN、Col Ⅳ等ECM的過度沉積相關(guān)，這些作用機(jī)制的揭示為通肺絡(luò)補(bǔ)宗氣方的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。