曲 怡，王建波，薛亞楠，鄧婷月，勇入琳，劉 路，張立德

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110847)

高血壓是指以體循環(huán)動(dòng)脈血壓(收縮壓和/或舒張壓)增高為主要特征(收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg)，可伴有心腦腎等器官的功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征[1]。研究顯示，高血壓可導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)體液等諸多異常變化，是引起心肌病理性改變的重要疾病之一。高血壓患者同時(shí)存在的壓力負(fù)荷和容量負(fù)荷均可增加心肌細(xì)胞容積，增大心肌細(xì)胞尺寸，改變膠原蛋白基質(zhì)成分而最終引起心肌肥厚，是引起腦卒中、冠心病和腎功能損傷等疾病的重要危險(xiǎn)因素。中醫(yī)將其歸屬于“眩暈”“頭痛”“肝風(fēng)”等病證范疇。近年來(lái)中醫(yī)藥治療高血壓病取得了一定成效，并充分體現(xiàn)了臨床的實(shí)用價(jià)值[2-4]。

現(xiàn)代研究證實(shí)，腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與高血壓的發(fā)病和心房重塑，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)與其主要受體血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)結(jié)合后可改變心肌離子通道表達(dá)及功能，促進(jìn)組織氧化張力及炎癥反應(yīng)，引起心房纖維化和心肌肥大等[5]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路是胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的主要信號(hào)通路，具有抗氧化、抗凋亡等心肌保護(hù)作用；原發(fā)性高血壓由于RAS過(guò)度激活，打破了RAS與胰島素信號(hào)之間串活平衡的本質(zhì)，是RAS的主要效應(yīng)因子AngⅡ表達(dá)上調(diào)后抑制了胰島素信號(hào)通路PI3K/AKT的活性[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯在改善血液流變學(xué)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和逆轉(zhuǎn)高血壓左室肥厚、改善高血壓患者左室舒張功能方面均有明顯療效[9-10]。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)高血壓模型大鼠的AngⅡ/AT1R與PI3K/AKt信號(hào)通路的影響，闡釋補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)高血壓所致心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供：7周齡鹽抵抗大鼠(SS)10只，體質(zhì)量190～210 g(許可證編號(hào)SCXK(京)2016-0006)；7周齡鹽敏感大鼠(DS)30只體質(zhì)量190～210 g(許可證編號(hào)SCXK(京)2016-0006)。飼養(yǎng)環(huán)境：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度為22±1 ℃，濕度為45±5%。

1.2 儀器及試劑

智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(BP-2010 A日本)；熒光定量PCR儀(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm)、ABI Veriti 梯度PCR儀器(Applied Biosystems)、超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000)、多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax I3,奧地利MD公司)。Trizol? Reagent(Invitrogen life technologies)；引物設(shè)計(jì)合成(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)、PCR反轉(zhuǎn)試劑盒(ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit)、熒光定量PCR試劑盒(Agilent Technologies)；MinuteTM總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒(凱基生物)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(凱基生物)、一抗兔抗大鼠AT1R(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0630R)；AngⅡ ELISA試劑盒(Biotech公司，Cat.#EIA-3667)。

1.3 藥物制備

補(bǔ)陽(yáng)還五湯，藥用：黃芪30 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，當(dāng)歸6 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g；以上劑量為成人一日劑量，共52.5 g，按照成人和大鼠給藥量換算，100 g大鼠給藥量為0.55 g。將補(bǔ)陽(yáng)還五湯水濃縮至0.55 g/ml后，分裝置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?中藥購(gòu)自遼寧省中醫(yī)院中藥局)。纈沙坦由魯南貝特制藥有限公司提供。

2 方法

2.1 分組與造模

所有大鼠統(tǒng)一于SPF級(jí)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。SS大鼠10只為正常組；DS大鼠30只隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組。8% Nacl高鹽飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供)喂食28 d，期間采用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)大鼠血壓，28 d后當(dāng)血壓值升至140 mmHg/90 mmHg以上時(shí)，確定為高血壓大鼠模型。停止高鹽喂養(yǎng)改為普通飼料(遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供)喂養(yǎng)。中藥組和西藥組分別給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯、纈沙坦灌胃治療，飼養(yǎng)期間自由飲食飲水。

2.2 干預(yù)方法

中藥組大鼠給藥量(大鼠體質(zhì)量每100 g給藥量為0.55 g/ml)，西藥組大鼠給藥量(3 mg/100 g大鼠)[11]，正常組和模型組大鼠給予等量蒸餾水灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃5周。

2.3 取材

灌胃治療5周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉(4 ml/kg體質(zhì)量)，待大鼠完全麻醉后打開(kāi)大鼠胸腔，剪取左心室心肌組織置于無(wú)菌EP管內(nèi)，迅速液氮浸泡后凍存于-80 ℃冰箱待用。

2.4 檢測(cè)方法

2.4.1 大鼠血壓的測(cè)量 測(cè)量方法：于安靜封閉的環(huán)境中，接好電源，打開(kāi)主機(jī)，待設(shè)定溫度升高至39 ℃，將大鼠置于系統(tǒng)固定容器內(nèi)，將感應(yīng)器穿過(guò)鼠尾并固定于鼠尾根部，松緊適度，待動(dòng)物安靜后尾套充氣系統(tǒng)自動(dòng)加壓放氣，血壓儀顯示屏上觀察老鼠的血壓波形并記錄，每只大鼠重復(fù)測(cè)量3次取平均值。每只大鼠測(cè)量時(shí)間為30 min，避免大鼠躁動(dòng)對(duì)血壓造成影響。

2.4.2 ELISA法檢測(cè)大鼠左心室心肌組織AngⅡ含量 取左心室心肌組織100 mg，加入PBS制成10%組織勻漿液，離心后取上清；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔加入待測(cè)樣本50 μL，空白孔不加；除空白孔外其余各孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴60 min；棄去液體，洗滌液反復(fù)洗滌5次；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值；通過(guò)公式y(tǒng)=ax+b轉(zhuǎn)換計(jì)算AngⅡ含量。

2.4.3 Western blot法檢測(cè)左心室心肌組織內(nèi)AT1R的蛋白表達(dá) 于冰箱中取出凍存的心臟組織，每組取3只老鼠，MinuteTM總蛋白提取試劑盒提取各組大鼠心臟組織蛋白，BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量。80μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳及電轉(zhuǎn)移PVDF膜后，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，一抗4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌5次，5 min/次；HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌5次，ECL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行曝光。GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶進(jìn)行對(duì)比分析。

2.4.4 熒光定量PCR 法檢測(cè)大鼠左心室心肌組織 PI3K、AKt的mRNA表達(dá) 于冰箱內(nèi)取出心臟組織，每組取3只老鼠，Trizol法提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,設(shè)定反轉(zhuǎn)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個(gè)循環(huán)。表1顯示，熒光定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)量檢測(cè)，熔解反應(yīng)按ABI 7500自動(dòng)設(shè)定的條件進(jìn)行，△△CT法對(duì)Real-time PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 引物信息比較

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血壓變化比較

表2顯示，造模前后及治療后各組大鼠血壓變化比較。

表2 造模前后各組大鼠血壓變化比較

注：與正常組比較:*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05；與中藥組比較:#P<0.05

3.2 各組大鼠左心室心肌組織AngⅡ、AT1R含量比較

表3圖1顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織AngⅡ及AT1R表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠心肌組織AngⅡ、AT1R表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，且西藥組心肌組織AngⅡ、AT1R表達(dá)水平低于中藥組(P<0.01)。

圖1 各組大鼠左心室心肌組織AT1R含量比較

表3 各組大鼠左心室心肌組織AngⅡ、AT1R蛋白含量及PI3K、AKT mRNA含量比較

注：與正常組比較:*P<0.01；與模型組比較:△P<0.01；與中藥組比較:#P<0.01

3.3 各組大鼠左心室心肌組織PI3K、AKt mRNA表達(dá)比較

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織PI3K、AKt的mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠心肌組織PI3K、AKt的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，且西藥組心肌組織AngⅡ表達(dá)水平高于中藥組(P<0.01)。

4 討論

伴隨著生活節(jié)奏的加快，緊張、肥胖、高鹽飲食等不良生活方式，使高血壓成為嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，也是亞洲的高流行區(qū)域，經(jīng)年齡調(diào)整的高血壓患病率為20%～30%，且增長(zhǎng)速率顯著快于西方國(guó)家[12]。近年來(lái)，此病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，15歲以上人群的發(fā)病率約為11%，是冠心病、腦卒中等疾病的重要危險(xiǎn)因素。研究證實(shí)，以高血壓為原發(fā)病的各種心腦血管疾病已成為人類死因之首。高血壓是一種多因素所致的疾病，與鹽的攝入密切相關(guān)，且高鹽攝入已成為高血壓病的一個(gè)獨(dú)立因素，Luft等率先提出鹽敏感性高血壓(SSH)的概念。大量流行病學(xué)和臨床研究證實(shí)，鈉鹽攝入過(guò)多是原發(fā)性高血壓發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)境因素[13-17]。

RAAS作為調(diào)節(jié)血壓和體液平衡的典型循環(huán)與內(nèi)分泌系統(tǒng)，在鹽敏感性高血壓的發(fā)病中起重要作用[18-19]。AngⅡ促進(jìn)血管收縮和腎上腺皮質(zhì)分泌的醛固酮具有保鈉排鉀的作用，促進(jìn)鈉和水的重新收進(jìn)而激活RAAS系統(tǒng)，引起血壓增高。目前研究認(rèn)為，高鹽攝入引起的高血壓會(huì)使強(qiáng)心類物質(zhì)增加而抑制鈉泵，最終導(dǎo)致血管平滑肌和心肌的收縮而引起高血壓[20-21]。AngⅡ/AT1R信號(hào)通路與心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等心肌損傷密切相關(guān)，此通路的激活還是心肌肥大發(fā)生的機(jī)制之一。對(duì)于高血壓來(lái)說(shuō)，心肌肥大是對(duì)長(zhǎng)期后負(fù)荷超載的血流動(dòng)力學(xué)改變的一種適應(yīng)性反應(yīng)。研究證實(shí)，壓力負(fù)荷和容量負(fù)荷所造成的機(jī)械應(yīng)力增加是心肌肥大的始發(fā)因素，高血壓大鼠存在心肌肥大的改變[22]。

PI3K/AKt是胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞的主要信號(hào)通路，除了具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、凋亡等重要功能，還在心肌保護(hù)中占有重要地位。在信號(hào)分子水平上表現(xiàn)為AngⅡ/AT1R信號(hào)通路與PI3K/AKt信號(hào)通路之間存在串活7074。大量證據(jù)表明，原發(fā)性高血壓由于RAS過(guò)度激活，打破了其與胰島素信號(hào)之間串活的平衡，最終導(dǎo)致胰島素信號(hào)通路失活的本質(zhì)是RAS的主要效應(yīng)因子AngⅡ表達(dá)上調(diào)后抑制了胰島素信號(hào)通路PI3K/AKt的活性[6, 23]。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠AngⅡ、AT1R含量升高，PI3K、AKt mRNA下降，表明鹽敏感高血壓大鼠心肌組織的確有AngⅡ/AT1R信號(hào)通路的激活和PI3K/AKt信號(hào)通路的抑制。補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以顯著下調(diào)AngⅡ、AT1R的含量，上調(diào)PI3K、AKt mRNA的表達(dá)，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以抑制AngⅡ/AT1R信號(hào)通路的激活，緩解AngⅡ/AT1R與PI3K/AKt信號(hào)通路的失衡狀態(tài)，降低血壓，保護(hù)心肌組織的損傷，延緩高血壓對(duì)靶器官的損傷。