王婭玲 陶然 梁峰源 李佳懌 于佩琳 韓凱月 高世杰

摘 ?????要：通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化中藥降脂復(fù)方中總多糖最佳提取工藝，計(jì)算了最佳提取條件下總多糖得率，通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其藥理作用。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用超聲法優(yōu)化總多糖的提取工藝，通過(guò)自由基清除率分析其抗氧化能力。結(jié)果為向1 g中藥復(fù)方粉末中加入30 mL蒸餾水，水浴超聲50 min，酸堿度為9的情況下總多糖得率最高，自由基清除率為84.93%。

關(guān) ?鍵 ?詞：高血脂;總多糖含量;響應(yīng)面優(yōu)化;體外抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ 041??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A ?????文章編號(hào)： 1671-0460（2020）03-0555-04

Optimization?of Lipid-lowering Compound Polysaccharide Extraction

Process by Response Surface Method and Its?Antioxidant Ability

WANG Ya-ling，?TAO Ran，?LIANG Feng-yuan，?LI?Jia-yi， YU Pei-lin，?HAN Kai-yue， GAO Shi-jie

（Shandong University of traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355，China）

Abstract：?By optimizing the optimal extraction process of total polysaccharide in the refaton-reducing complex of Traditional Chinese medicine by the response surface method， the total polysaccharide yield rate under the optimal extraction condition was calculated， and its pharmacological effect was evaluated by in vitro antioxidant experiments. According to the results of single-factor experiments， the extraction process of total polysaccharide was optimized by ultrasonic method， and the antioxidant capacity of free radical removal was analyzed by free radical removal rate. Results For the addition of 30 mL distilled water to 1g Chinese medicine compound powder， water bath ultrasound 50 min， acidity and alkalinity of 9 cases， the total polysaccharide yield is the highest， free radical removal rate of 84.93%.

Key words：?high blood fat; total polysaccharide content; response surface optimization;?in vitro antioxidant

研究表明，自由基過(guò)量易損傷細(xì)胞，對(duì)人體有潛在危害，因此研究抗氧化活性減少自由基的產(chǎn)生或加速清除研究，日益成為市場(chǎng)最重要的功能性訴求之一^[1]，此方為王集會(huì)教授根據(jù)多年實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的新配方，多糖為方中主要有效成分之一，能清除多余自由基、促進(jìn)脂質(zhì)代謝^[2]、提高免疫力。

該復(fù)方包括荷葉、薏苡仁、人參、白術(shù)、當(dāng)歸、大黃、山楂等中藥，涂宗財(cái)^[3]等研究表明荷葉多糖具有較好的抗氧化活性，超聲水提法與傳統(tǒng)熱水浸提法相比多糖得率更高;李珊珊^[4]等研究表明人參多糖能夠調(diào)節(jié)人體代謝、增強(qiáng)人體免疫力，臨床應(yīng)用效果顯著;石娜^[5]等通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)表明白術(shù)多糖可以清除人體自由基，具有良好的抗氧化活性。目前人們?cè)絹?lái)越熱衷于復(fù)方配伍的研究，這幾味中藥聯(lián)合使用可增強(qiáng)藥效^[6]，減輕毒副作用。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以最終測(cè)得總多糖得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件，依據(jù)各個(gè)因素的相互作用與顯著性，測(cè)定降脂復(fù)方中總多糖對(duì)體內(nèi)多余的自由基清除率，初步評(píng)價(jià)其抗氧化能力，對(duì)降血脂新藥和保健品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?藥品

此方包括陳皮、荷葉、薏苡仁、靈芝等20味中藥，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自制得到干燥粉末。

1.2??試劑

苯酚、濃硫酸、無(wú)水葡萄糖等。

1.3??儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);冷凍離心機(jī)^[7];移液槍;超聲清潔儀;真空抽濾泵等。

2??實(shí)驗(yàn)方法

2.1??響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)方法采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定恒重葡萄糖的吸光度，?所得回歸方程為：

y?= 0.502 9x?+ 0.007?5，R² = 0.998 3

表明該中藥復(fù)方總多糖含量測(cè)定線性良好^[8]，實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.1.2??中藥降脂復(fù)方中總多糖含量測(cè)定

精確稱(chēng)取1.0 g中藥纖體粉末，調(diào)至料液比為1∶30、pH=9，保持40 ℃不變超聲50 min，離心，抽濾，定容至100 mL， 吸取2 mL待測(cè)溶液，按“2.1.1”方法測(cè)定待測(cè)溶液總多糖含量^[9]。

2.1.3??單因素實(shí)驗(yàn)

見(jiàn)表1，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g粉末，提取制備待測(cè)溶液，分析不同條件下超聲時(shí)間（A）、料液比（B）、pH值（C）三個(gè)因素對(duì)降脂復(fù)方中總多糖提取的影響^[10]。

2.1.4??響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察三個(gè)影響因素及其交互作用對(duì)中藥復(fù)方中總多糖提取的影響，確定超聲輔助法提取的最佳工藝，獲取所需實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)^[11]。

2.2??體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

見(jiàn)表2，配制抗氧化實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)DPPH溶液，于520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同待測(cè)溶液的吸光度，結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸，分析降脂復(fù)方中總多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力。

3??實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1??響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分析單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對(duì)三個(gè)因素進(jìn)行分析，建立參數(shù)回歸模型進(jìn)行方差分析，得到回歸方程：Y=53.73+0.063A+0.96B+1.67C+0.30AB+0.47AC-0.35BC-2.70A²-3.05B²-0.43C²，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

見(jiàn)表4，A（超聲時(shí)間）、B（料液比）對(duì)總多糖含量測(cè)定影響不顯著，C（pH值）對(duì)總多糖含量測(cè)定影響顯著;二次項(xiàng)中，P值均小于0.05，A²、B²對(duì)結(jié)果影響顯著，C²對(duì)復(fù)方中總多糖得率影響不明顯^[12]，?P值大于0.05;同時(shí)，方差分析結(jié)果表明，三個(gè)影響因素兩兩之間的交互作用對(duì)多糖測(cè)定作用較小^[13]。方差分析R²=0.870?0， R_adj²=0.703?0，表明擬合度較好，實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作較為嚴(yán)謹(jǐn)，70.30%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到影響，該回歸模型可用于降脂復(fù)方總多糖提取工藝的分析與預(yù)測(cè)^[14]。

3.2??交互作用分析

響應(yīng)面曲線開(kāi)口朝下，說(shuō)明多糖得率在0.2～0.6 mg·g^-1范圍內(nèi)存在最大值。

由圖1可知，固定pH值不變，僅考慮料液比和超聲時(shí)間的影響，二者都對(duì)多糖溶出有促進(jìn)作用^[15]。曲面較陡，等高線稀疏^[16]， 其交互作用干擾較小。超聲超過(guò)50 min后得率開(kāi)始降低，可能原因?yàn)槌晻r(shí)間為50 min時(shí)，細(xì)胞壁被超聲波破壞， 在超聲輔助下多糖充分溶解，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，非多糖類(lèi)成分溶出，干擾多糖的提取，使總多糖得率降低。

由圖2可知，曲面較為平緩，等高線稀疏，表明pH值和料液比對(duì)多糖浸出影響不顯著，其交互作用對(duì)響應(yīng)值干擾也較小，多糖浸出率受pH值的影響大于料液比的影響。多糖含量受提取溶劑的影響較大，但提取溶劑過(guò)多，其他因素的干擾作用也加大，多糖溶出受到抑制;固定超聲時(shí)間不變，僅考慮料液比和pH值的影響，在酸性條件下，pH的改變幾乎對(duì)多糖含量測(cè)定沒(méi)有影響，強(qiáng)堿性條件下，多糖結(jié)構(gòu)破壞，使得率降低，pH=10時(shí)，多糖得率最高。

由圖3可知，雙曲面較平緩，等高線呈橢圓形，分布較為密集，表明pH值和超聲時(shí)間對(duì)復(fù)方總多糖測(cè)定的影響弱于其交互作用，多糖浸出率受pH值的影響大于超聲時(shí)間的影響，可能原因多糖被分解破壞，蛋白、黃酮等其他物質(zhì)溶出。

3.3??體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)抗氧化能力的常見(jiàn)指標(biāo)。人體許多疾病的發(fā)生與自由基關(guān)系密切，自由基氧化反應(yīng)對(duì)人體細(xì)胞具有一定的損害作用。見(jiàn)圖4，復(fù)方中多糖對(duì)DPPH自由基清除效果較好，在0.2～0.6?mg·mL^-1范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率呈上升趨勢(shì)，清除率與濃度呈正相關(guān)^[17]，抗氧化能力強(qiáng)于相同條件下的抗壞血酸，因此其抗氧化能力與稀釋度成線性相關(guān)，實(shí)際應(yīng)用中可適當(dāng)增加濃度來(lái)提高藥效。

4??結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，采用BoxBehnken法優(yōu)化總多糖提取工藝，以料液比、超聲時(shí)間、pH值為因素^[18]，并在最佳條件下進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)響應(yīng)面方差分析，研究各因素與響應(yīng)值之間影響強(qiáng)弱并對(duì)其優(yōu)化和評(píng)價(jià)。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)確定為向1 g中藥復(fù)方粉末中加入30 mL蒸餾水、水浴超聲50 min、酸堿度為9的情況下，此時(shí)總多糖得率為5.405%。根據(jù)F值可知， 三個(gè)因素中pH值影響最大，提取溶劑的用量次之，超聲時(shí)間影響最小。體外藥理實(shí)驗(yàn)表明^[19]，降脂復(fù)方中DPPH自由基清除率為84.93%，具有顯著的抗氧化活性，為開(kāi)發(fā)高效降脂藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究表明植物多糖具有顯著降低血脂含量的作用，可調(diào)節(jié)免疫代謝、保護(hù)心腦血管，在治療高脂癥方面應(yīng)用前景廣闊。中藥降脂復(fù)方可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂^[20]、減少脂質(zhì)的吸收，因其效果顯著，用藥安全，吸引越來(lái)越多的學(xué)者熱衷于中藥調(diào)節(jié)血脂的研究^[21]。復(fù)方中百合、山藥、山楂、薏苡仁等中藥既有藥用價(jià)值，也有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值^[22]。在日常生活中，可以作為食物長(zhǎng)期使用從而達(dá)到養(yǎng)生保健、降低血脂的作用^[23]， 促使中藥食品化、現(xiàn)代化。

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