劉小飛 王旭 王鵬杰 張思薈 張炎

摘 要：以結冷膠和無水氯化鈣為內水相凝固劑，酪蛋白酸鈉為外水相乳化劑，制備一種水包油包膠（S/O/W）型乳液。以多重乳液粒徑和分布為指標，研究酪蛋白酸鈉添加量對S/O/W型多重乳液加工適應性的影響。結果表明：正交試驗得到S/O型單重乳液最佳制備條件為：內水相中結冷膠添加量0.2%、無水氯化鈣添加量0.5%;內水相乳化劑聚甘油蓖麻醇酯添加量2.5%;油相為精煉豬油，油水體積比3∶2;剪切速率17 500 r/min，剪切時間1.5 min。將制得的S/O型單重乳液與不同添加量酪蛋白酸鈉混合制得S/O/W型多重乳液。當酪蛋白酸鈉添加量0.1%時，S/O/W型多重乳液粒徑符合加工要求，且貯藏、熱處理、剪切穩(wěn)定性較好。以多重乳液替代豬脂肪制備的低脂乳化腸與高脂（精煉豬油含量20%）乳化腸外觀不存在明顯差異;微觀結構觀察結果表明，多重乳液在乳化腸中包裹良好、分布均勻。

關鍵詞：水包油包膠（S/O/W）型乳液;結冷膠;豬油;酪蛋白酸鈉;聚甘油蓖麻醇酯;乳化腸

Abstract： In this paper， a new solid-in-oil-in-water （S/O/W） emulsion was developed using gellan gum and? calcium chloride as the inner aqueous phase coagulant and caseinate sodium as the outer aqueous phase coagulant. The effect of the amount of caseinate sodium on the processing suitability of S/O/W emulsions was investigated by measuring particle size and size distribution. Using an orthogonal array design， the optimum conditions for preparing single aqueous phase emulsions were determined as follows： 0.2% （m/m） gellan gum and 0.5% calcium chloride， 2.5% polyglycerolpolyricinoleate in the inner aqueous phase， refined lard-water at 3：2 （V/V） as the oil phase， shear rate 17 500 r/min， and shearing time 1.5 min.?S/O/W emulsions were obtained by mixing the single aqueous phase emulsion with different amounts of caseinate sodium， and the one with 0.1% caseinate sodium met the requirements for processing and was stable to storage， thermal treatment and shearing treatment. There was no striking difference in the appearance of low-fat emulsified sausages with the S/O/W?emulsion as a fat replacer compared to high-fat emulsified sausages with 20% refined lard. Laser confocal microscope showed that fat was dispersed better in the low-fat sausages than in the control.

Keywords： solid-in-oil-in-water （S/O/W） emulsion; gellan gum; refined lard; sodium caseinate; polyglycerol polyricinoleate; emulsified sausages

多重乳液是指在一種乳狀液分散相的微滴中分布有另一種分散相的復合乳液體系。目前研究較多的是水包油包水（W/O/W）型多重乳液，即將油包水型（W/O）乳液進一步分散在水相中[1]。多重乳液包含多種組分，既有親油性組分（如油膜），又有親水性組分，兩類組分通過乳化劑交聯(lián)在一起。食品工業(yè)利用多重乳液的兩親性包埋風味物質、生物活性成分、易氧化成分或者益生菌，進而掩蓋不良風味、改善口感和營養(yǎng)、提高活性成分的利用率、抗氧化性以及提高益生菌的存活率[2-7]。此外，W/O/W型多重乳液的內水相為油包水，因而其與實心脂肪球的感官特性相同，可作為脂肪替代物應用于干酪、乳化腸等產品中，因此在保證食品口感的前提下，可用于降低食品中的脂肪含量[8-11]。

然而，W/O/W型多重乳液易發(fā)生聚并、絮凝等現(xiàn)象，從而影響加工制品的穩(wěn)定性[12-13]。因此，相關研究通過向內水相中添加凝固劑及輔助離子使內水相凝膠化，進而提高多重乳液的穩(wěn)定性。已有研究采用明膠、果膠、瓜爾膠等作為內水相凝膠化材料并取得了較好效果[14-16]，但在內水相凝膠化時這些凝膠的用量較高。結冷膠是一種分子質量達1×106 Da的多糖，可在食品中作為穩(wěn)定劑、增稠劑使用。結冷膠在極低的使用量下就能形成良好的凝膠，添加0.25%結冷膠的凝膠強度與添加1.5%瓊脂或1%卡拉膠相同[17]，并且具有良好的熱穩(wěn)定性和較強的結合水能力，因此比較適合作為內水相凝固劑。此外，添加Ca2+和Na+可改善結冷膠的凝膠特性，使其融化溫度達到80 ℃以上[18]。目前，以結冷膠為內水相凝固劑制備多重乳液的研究鮮見報道。

目前，研究多采用植物油制備多重乳液[19-22]，但植物油與動物脂肪風味差異較大，并且消費者的感官嗜好性亦存在差異。研究表明采用豬油制備的多重乳液具有更好的穩(wěn)定性[11]，且更符合消費者對脂肪的口感嗜好。在我國，火腿腸、午餐肉等乳化型肉制品廣受歡迎，但此類肉制品脂肪含量通常高達20%～30%[23]。本研究以結冷膠為內水相凝固劑，聚甘油蓖麻醇酯（polyglycerol polyricinoleate，PGPR）為內水相乳化劑，酪蛋白酸鈉為外水相乳化劑，制備一種粒徑符合生產加工要求的水包油包膠（S/O/W）型脂肪替代物;并將其用于制備低脂乳化腸，進一步考察低脂乳化腸的宏觀和微觀結構，探討其加工穩(wěn)定性及品質，以期為水包油包膠（S/O/W）型乳液在乳化腸中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精煉豬油 上海楓未實業(yè)有限公司;豬肉 北京美廉美超市;無水氯化鈣（食品級） 國藥集團化學試劑有限公司;結冷膠、酪蛋白酸鈉（食品級） 美國Sigma公司;PGPR 愛爾蘭Kerry公司。

1.2 儀器與設備

XMTD-6000電熱恒溫振蕩水浴鍋 北京長風儀器儀表公司;T25高速分散機 德國IKA公司;AH-100D高壓納米均質機 加拿大ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司;Zetasizer nano ZSP粒度電位儀、Mastersizer 3000激光粒度儀?英國Malvern儀器有限公司;Turbiscan Tower穩(wěn)定性分析儀 法國Formulaction公司;A1RsiHD25超分辨激光掃描共聚焦顯微鏡 尼康（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 S/O型單重乳液的制備

參考Cofrades等[1]的方法并略作修改。將一定量結冷膠溶于70 ℃超純水中，加入質量分數(shù)0.5%無水氯化鈣溶液溶解，70 ℃水浴，制得凝膠相。將精煉豬油加熱至70 ℃融化后，加入一定量PGPR溶于融化的豬油中，70 ℃水浴，制得油相。將油相與凝膠相按體積比3∶2混合，用高速分散機9 500 r/min預剪切30 s后，再在不同剪切速率下剪切一定時間制得S/O型單重乳液。

1.3.2 S/O型單重乳液制備工藝條件優(yōu)化

根據(jù)預實驗結果，采用控制變量法完成單因素試驗。固定結冷膠添加量0.4%、PGPR添加量3%、剪切速率17 500 r/min、剪切時間2 min，分別考察不同結冷膠添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、PGPR添加量（2%、3%、4%、5%）、剪切速率（6 500、9 500、13 500、17 500、21 500 r/min）以及剪切時間（0、1、2、3 min）對乳液粒徑的影響。在單因素試驗基礎上，以結冷膠添加量、PGPR添加量、剪切速率及剪切時間為因素設計L9（34）正交試驗確定S/O型單重乳液的最佳制備條件。

1.3.3 S/O型單重乳液粒徑測定

采用粒度電位儀測定S/O型單重乳液粒徑。將樣品用正十六烷稀釋50 倍。測試程序設定為溶劑折射率1.434、黏度3.13 mPa·s、溫度45 ℃。

1.3.4 S/O/W型多重乳液的制備

參考Cofrades等[1]的方法并略作修改。以0.01%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%酪蛋白酸鈉為外水相乳化劑，將S/O型乳液于60 ℃下水浴融化，以體積比1∶4與外水相混合后用高速分散機9 500 r/min預剪切30 s，然后用高壓均質機于5 MPa下均質3 次，最后得到S/O/W型多重乳液。

1.3.5 S/O/W型多重乳液粒徑測定

用激光粒度儀測定多重乳液顆粒粒徑，設定折光指數(shù)1.54，吸光率0.001，加入樣品直至遮光度為10%～20%，測試溫度25 ℃，結果以體積面積平均粒徑（D[3，2]）表示。

1.3.6 S/O/W型多重乳液貯藏、剪切及熱穩(wěn)定性測定

用Turbiscan穩(wěn)定性分析儀測定多重乳液貯藏穩(wěn)定性，參考李洪亮等[24]的方法并稍加修改，將多重乳液在25 ℃下貯藏36 h，每110 s掃描1 次，根據(jù)儀器自帶的軟件計算體系穩(wěn)定性指數(shù)（turbiscan stability index，TSI），計算公式如下。

式中：xi為在某一高度處單次測量所獲得的樣品的背散射光強值/%;xBS為樣品自上而下掃描后所測得的xi的平均值;n為掃描的總次數(shù)。

分別制備酪蛋白酸鈉添加量為0.01%、0.05%、0.10%的多重乳液，并分為兩部分。將一部分多重乳液于80 ℃水浴加熱20 min，用于熱穩(wěn)定性測定，用激光粒度儀測定加熱前后多重乳液脂肪顆粒粒徑及分布，儀器參數(shù)同1.3.5節(jié)。另一部分多重乳液用高速剪切儀于6 500 r/min條件下剪切10 min，用于剪切穩(wěn)定性測定，用激光粒度儀測定剪切處理前后多重乳液脂肪顆粒粒徑大小及分布，儀器參數(shù)同1.3.5節(jié)。

1.3.7 S/O/W型多重乳液制備乳化腸

結合1.3.5及1.3.6節(jié)實驗結果，將1.3.4節(jié)制備的多重乳液于5 000×g離心30 min，取上層，得到S/O/W型脂肪替代物。按配方（表1）制作乳化香腸，以豬脂肪為對照組，S/O/W型脂肪替代物為低脂組。

乳化腸制作工藝：1）原料肉修整：取新鮮豬后腿肉，去除結締組織，切分為3 cm×3 cm×3 cm肉塊，絞肉機絞成細餡;2）斬拌：稱取1/4所需冰量將斬拌機預冷至10 ℃左右，放入肉餡3 000 r/min斬拌2 min，加入脂肪、輔料和剩余冰水，高速斬拌6 min，控制斬拌溫度不超過13 ℃;3）灌腸：將肉糜填充于直徑22 mm天然風干腸衣中，每10 cm用棉線系緊，用針頭在腸體扎若干小孔以防蒸煮時膨脹破裂;4）蒸煮：將香腸置于80 ℃水浴中加熱，待中心溫度升至72 ℃，迅速用自來水冷卻至室溫并擦干表面水分;5）風干：在鼓風干燥機中干燥5 min，烘干腸體表面水分。

1.3.8 乳化腸微觀結構觀察

參照Lopez等[25]的方法，用刀片將乳化香腸樣品切成厚約2 mm的薄片，置于載玻片上，滴加1.0 g/L快綠超純水溶液，在暗室下充分染色5 min，之后滴加0.1 g/L尼羅紅乙醇溶液，再在暗室下充分染色5 min。染色完成后，用超純水從樣品一角緩慢洗掉多余染料，并用少量擦鏡紙清潔載玻片上多余液體，覆蓋蓋玻片。用超分辨激光掃描共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長（尼羅紅488 nm、快綠633 nm）下進行逐行倒置掃描，標尺為100 μm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示;使用Graphpad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析和鄧肯多重比較進行差異顯著性分析，顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 S/O型單重乳液制備的最佳工藝條件

2.1.1 S/O型單重乳液制備單因素試驗結果小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。下同。

前期預實驗結果表明，市售乳化腸中脂肪顆粒平均粒徑約為5.5 μm，且單重乳液粒徑為多重乳液粒徑1/10時，制備的多重乳液穩(wěn)定，故單重乳液粒徑參考值為0.55 μm。PGPR作為一種親油性表面活性劑，在乳液制備中具有良好的油水乳化特性[26]。由圖1A可知，隨著PGPR添加量的增加，S/O型單重乳液的粒徑顯著降低（P<0.05）。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規(guī)定PGPR可作為乳化劑、穩(wěn)定劑用于水油狀脂肪乳化制品，最大使用量不超過10 g/kg。根據(jù)GB 2760—2014中食品添加劑的使用原則，在滿足使用要求的情況下，應盡可能少地使用添加劑，因此選擇PGPR添加量為2.5%、3.0%、3.5%進行正交試驗。均質工藝對乳液顆粒粒徑具有重要影響[27]。由圖1B可知，剪切速率越大，所得S/O型單重乳液顆粒粒徑越小，但經21 500 r/min剪切后乳液中出現(xiàn)較多氣泡，這可能與速率過高而產生的強大空穴與湍流作用有關[28]。剪切速率過高或過低，都不利于形成穩(wěn)定均一的乳液，考慮到剪切速率對S/O型單重乳液顆粒粒徑特性及穩(wěn)定性等因素的影響，確定剪切速率為17 500 r/min。由圖1C可知，剪切時間越長乳液顆粒粒徑越小，但剪切3 min時出現(xiàn)了較多氣泡。綜合考慮，選擇剪切時間1.0、1.5、2.0 min進行正交試驗。由圖1D可知，隨著結冷膠添加量的增加，S/O型單重乳液顆粒粒徑整體呈下降趨勢，但結冷膠添加量為0.2%～0.4%時乳液粒徑無顯著差異，考慮到單重乳液粒徑參考值，選擇結冷膠添加量0.2%、0.3%、0.4%進行正交試驗。

2.1.2 正交試驗優(yōu)化S/O型單重乳液制備條件

根據(jù)單因素試驗結果，以剪切速率、剪切時間、PGPR添加量和結冷膠添加量為因素，其中剪切速率固定為17 500 r/min，設計L9（34）正交試驗確定制備最佳條件。

通過表2分析極差可知，影響S/O型乳液顆粒粒徑的主要因素主次關系為C>A>B，最佳組合為A3B1C1，即剪切時間1.5 min、PGPR添加量2.5%、結冷膠添加量0.2%。由于最佳組合未在表2中出現(xiàn)，經驗證實驗可知，此條件下制得的S/O/W型乳液顆粒粒徑為548.5 nm，與單重乳液粒徑參考值最為接近。

2.2 外水相乳化劑對S/O/W型多重乳液穩(wěn)定性的影響

2.2.1 酪蛋白酸鈉添加量對S/O/W型多重乳液粒徑及貯藏穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，S/O/W型多重乳液中脂肪替代物顆粒粒徑為5～7 μm，且隨著酪蛋白酸鈉添加量的增大，顆粒粒徑整體呈先增大后減小的趨勢，當添加量為0.20%時，顆粒粒徑最大。

TSI越大表明體系越不穩(wěn)定。由圖3可知，貯藏過程（0～36 h）中S/O/W型多重乳液TSI不斷升高，且酪蛋白酸鈉添加量越高，乳液TSI升高越快;當外水相酪蛋白酸鈉添加量為0.4%～0.5%，貯藏2～4 h時乳液穩(wěn)定性明顯下降，因此只需研究0.01%、0.05%、0.10%這3 個添加量所產生的影響。

2.2.2 酪蛋白酸鈉添加量對S/O/W型多重乳液熱穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，不同酪蛋白酸鈉添加量所制備的S/O/W型多重乳液經過熱處理后粒徑均增大，尤其是酪蛋白酸鈉添加量為0.10%時，乳液顆粒粒徑顯著增加（P<0.05）。由圖5可知，添加0.05%和0.10%的酪蛋白酸鈉乳液顆粒粒徑分布較均勻。

A. 酪蛋白酸鈉添加量0.01%;B. 酪蛋白酸鈉添加量0.05%;C. 酪蛋白酸鈉添加量0.10%。圖7同。

2.2.3 酪蛋白酸鈉添加量對S/O/W型多重乳液剪切穩(wěn)定性的影響

研究表明，內水相凝膠化可以提高多重乳液對高速剪切的耐受力，減少加工中失穩(wěn)現(xiàn)象的發(fā)生[29]。由圖6可知，添加0.01%、0.05%、0.10%酪蛋白酸鈉制備S/O/W型多重乳液，剪切處理后顆粒粒徑均增大。由圖7可知，酪蛋白酸鈉添加量為0.10%時，乳液顆粒粒徑分布均勻，呈單峰分布，而酪蛋白酸鈉添加量為0.05%和0.01%時，乳液顆粒粒徑分布不均勻，呈多峰分布。這可能是因為較低添加量的酪蛋白酸鈉不能較好地穩(wěn)定乳液，在剪切處理下乳液發(fā)生了明顯的聚集現(xiàn)象。

所示。對照組樣品中脂肪呈較大的團塊狀，未能較好地被包裹在蛋白網格內部;而低脂組中脂肪被充分包裹在蛋白質網格內部，證明多重乳液具有較好的乳化效果，并有利于形成更好的結構。

3 結 論

通過單因素和正交試驗確定了S/O型單重乳液的制備條件為：內水相中結冷膠添加量0.2%，無水氯化鈣添加量0.5%;油相中PGPR添加量2.5%，油水體積比3∶2;剪切速率17 500 r/min，剪切時間1.5 min。將S/O型單重乳液添加不同量酪蛋白酸鈉制得S/O/W型多重乳液。熱處理對S/O/W型多重乳液顆粒粒徑與分布沒有明顯影響，而剪切處理易引起低添加量酪蛋白酸鈉多重乳液發(fā)生失穩(wěn)和聚集現(xiàn)象。將S/O/W型脂肪替代物替代豬脂肪制作低脂乳化香腸，其外觀與高脂（精煉豬油含量20%）乳化香腸無明顯差異，但脂肪顆粒包裹良好、分布均勻，因此，S/O/W型脂肪替代物具有較好的乳化效果。

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