杜杰 余永 戴宏杰 馬良 張宇昊

摘 要：制備草魚魚糕，采用0.65 mg/L臭氧水溶液和10 mg/L二氧化氯（ClO2）聯合對魚糕進行預處理，研究該處理方式對魚糕冷藏（4 ℃）保質期及品質的影響。結果表明：臭氧-ClO2處理能夠有效延長草魚魚糕的保質期（與對照組相比延長10 d），4 ℃冷藏25 d后草魚魚糕的揮發(fā)性鹽基氮含量、菌落總數等指標均未超過國家相應限量標準;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，臭氧-ClO2處理可通過抑制內源酶活性來抑制蛋白質降解，從而提高魚糕的持水力，使草魚魚糕在貯藏過程中維持原有的白度和質構特性。

關鍵詞：草魚;魚糕;臭氧;二氧化氯;保質期;質構

Abstract： Fish cake from grass carp was prepared and pretreated with 0.65 mg/L ozone aqueous solution combined with 10 mg/L chlorine dioxide （ClO2） before storage at 4 ℃. Our objective was to study the effect of the treatment on the storage quality of fish cake. The results showed that the combined treatment could effectively extend the shelf life of fish cake by 10 days compared with the control group. After 25 days of storage， total volatile basic nitrogen （TVB-N） content and total plate count （TPC） still did not exceed the corresponding national limit standards. In addition， sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） analysis showed that ozone-ClO2 treatment could inhibit the degradation of protein by inhibiting the activity of endogenous enzymes， thereby improving water holding capacity， and maintaining the original whiteness and texture characteristics during storage.

Keywords： grass carp; fish cake; ozone; chlorine dioxide; shelf life; texture

我國水產品，尤其是淡水魚產品產量位居世界前列[1]，對淡水魚進行精深加工是目前淡水魚產品加工的主要方向。魚糕源自湖北荊州，是一種營養(yǎng)豐富、食用便捷的魚糜制品，然而，由于酶和微生物的作用，魚糕貯藏期間極易發(fā)生腐敗變質，因此如何延長魚糕制品的保質期是實現其規(guī)模生產的主要瓶頸。部分企業(yè)嘗試通過高溫殺菌處理來延長魚糕的保質期，但高溫殺菌會引起產品口感變差、顏色劣變等問題。因此研究有效保鮮技術提高魚糕品質，對全面提高淡水魚加工制品的綜合利用率和經濟價值具有重要意義。臭氧的殺菌速率是氯氣的600～3 000 倍，且其反應產物為水和氧氣，對環(huán)境無害[2]。

根據已有研究結果可知，臭氧的抗菌作用體現在各種生物體中，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌[3]、孢子及營養(yǎng)細胞[4]。ClO2是世界衛(wèi)生組織和美國農業(yè)部認定的A1級滅菌劑，具有較高的殺菌效率和安全性，在國內外得到廣泛應用，其應用范圍從最初的飲用水消毒已擴展到食品加工消毒和保鮮領域[5]，在食品消毒保鮮領域應用已較為成熟。近年來，許多研究表明，ClO2在貝類[6-8]、全魚[9]、魚片[10]、魚塊[5]、魚丸[11]、魚籽[12]及蝦類[13-14]等水產品及水產制品的消毒保鮮中均展現出較好效果。

杜杰等[15]采用ClO2處理鰱魚魚糕，考察其對魚糕貨架期及品質的影響，并探討作用機制，結果表明，ClO2處理能有效延長鰱魚魚糕的保質期、改善魚糕品質，這可能與ClO2對魚肉中內源性酶活性的抑制有關，單獨采用ClO2處理，魚糕貨架期可延長約5 d。為進一步延長保質期并改善魚糕品質，本研究擬聯合采用臭氧水溶液和ClO2溶液處理草魚魚糕，并對魚糕貯藏期間的菌落總數、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、質構、白度、持水性等指標進行測定，同時提取不同貯藏時間草魚魚糕的蛋白質，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚（體質量1 kg左右），購于重慶雄風超市（北碚店）。二氧化氯（食品級） 山東華實藥業(yè)有限公司;平板計數瓊脂（生物試劑） 杭州微生物試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷（Tris，優(yōu)級純）、考馬斯亮藍R-250（優(yōu)級純） 加拿大Bio Basic公司;氯化鈉注射液（生物試劑） 廣西裕源藥業(yè)有限公司;SDS（分析純） 天津市大茂化學試劑廠;5×蛋白上樣緩沖液（主要成分為SDS、巰基還原劑、溴酚藍和緩沖鹽溶液，優(yōu)級純） 北京索萊寶科技有限公司;氧化鎂、硼酸、三氯乙酸、鹽酸、冰乙酸（均為分析純） 成都市科龍化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

HH-4溫控水浴鍋 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠;101-4-S電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療儀器廠;Power PacTM基礎電泳儀 美國Bio-Rad公司;CT-3質構儀?美國博勒飛公司;FiveEasy 20 pH計 Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司;XHF-DF高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;DZ600/2S真空包裝機 上海人民包裝股份有限公司;UltraScan PRO測色儀 美國HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚魚糕制備工藝流程及操作要點新鮮草魚→剖殺→采肉（去魚皮、紅肉、魚刺）→漂洗→擂潰→成型→蒸制→真空包裝→4 ℃冰箱冷藏1）剖殺：新鮮草魚購買后，立即剖殺，去除頭、尾、內臟，清洗干凈;2）采肉：剔除魚皮、紅肉及魚刺，并將魚肉切分成小塊;3）漂洗：用自來水漂洗2 次，最后用鹽水（質量濃度1.5 g/L）漂洗8～10 min，然后繼續(xù)在鹽水中靜置10 min，瀝干水分，稱質量備用;4）擂潰：擂潰是指將魚肉斬剁成泥并與其他輔料混合均勻的過程，分3 步進行擂潰操作，即空擂（5 min）、鹽擂（加入2.5%～3.0%食鹽（以魚肉質量計，下同），15 min）及調味擂（飲用水15%、豌豆淀粉10%、雞蛋清5%、姜汁3%、蔥白汁3%），取少許經調味擂后的魚糜置于清水中，魚糜若能浮于水面即可終止擂潰;5）成型：將魚糜分為均勻小塊，每份約30 g，并整理成型;6）蒸制：將成型魚糜置于沸水蒸鍋中蒸制30 min;7）真空包裝：取出蒸制好的魚糕裝入真空包裝袋中，按照1.3.2節(jié)分組處理后，采用真空包裝機趁熱封裝，真空時間10 s，熱合時間4 s;8）冷藏：置于4 ℃冰箱中冷藏待用。

1.3.2 魚糕的減菌處理

將魚糕分為對照組和處理組，對照組即按1.3.1節(jié)操作進行，處理組在調味擂過程中以質量濃度0.65 mg/L的臭氧水溶液代替飲用水，并在真空包裝袋內壁均勻涂抹0.5 mL質量濃度10 mg/L ClO2溶液，再裝入蒸制好的魚糕樣品，趁熱真空包裝。

1.3.3 菌落總數測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數的測定》。測定貯藏1、5、10、15、20、25、30 d的樣品菌落總數和其他指標。

1.3.4 TVB-N含量測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法。重復測定2 次，取平均值。

1.3.5 pH值測定

參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》。取10 g魚糕絞碎，加入90 mL蒸餾水，8 000 r/min均質1 min，靜置15 min后測定pH值。重復測定3 次，取平均值。

1.3.6 持水力測定

取2 g魚糕攪碎后離心（5 000 r/min，5 min），離心后取沉淀稱質量，持水力按式（1）計算。

1.3.7 白度測定

將魚糕切為1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的薄片，采用測色儀測定魚糕的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。每個樣品進行4 次平行測定。白度計算采用亨特（Hunter）白度公式，按式（2）計算。

1.3.8 質構特性測定

將4 ℃條件下保存的魚糕切成1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm的方塊狀，使用CT-3質構儀測定魚糕的質構特性。探頭：PA11/1000;測試類型：TPA;壓縮距離5 mm;測試速率2 mm/s;觸發(fā)力5 g。得到硬度、彈性、咀嚼性和內聚性。每組樣品重復測定4 次，取平均值。

1.3.9 SDS-PAGE分析

稱取0.05 g魚糕，與5 mL 10 g/100 mL SDS溶液混合，將勻漿后的樣品置于80 ℃水浴1 h，隨后離心（3 000×g，15 min）取上清液，得到蛋白質樣品，然后取適量蛋白質溶液與5×蛋白上樣緩沖液混勻（4∶1，V/V），沸水浴加熱5 min，立即放置于-20 ℃冰箱中貯藏備用。

采用5%濃縮膠和10%分離膠，上樣量為8 μL，在15 mA條件下進行電泳，直至溴酚藍條帶移動至分離膠和濃縮膠的分界線，將電流切換到25 mA。電泳結束后，使用考馬斯亮藍R-250染色液進行染色，過夜染色后使用脫色液進行脫色，脫色過程中每半小時更換1 次脫色液，至底色接近淺藍色。染色液配制：0.5 g考馬斯亮藍R-250、500 mL甲醇、92 mL冰醋酸、408 mL蒸餾水。脫色液配制：75 mL冰醋酸、50 mL甲醇、875 mL蒸餾水。

1.4 數據處理

所有結果均以平均值±標準差表示。采用Microsoft Excel 2010軟件和SPSS 17.0軟件進行數據處理，并用Origin 8.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 臭氧-ClO2處理對魚糕貯藏期間菌落總數的影響小寫字母不同，表示相同貯藏時間、不同組差異顯著（P<0.05）。下同。

菌落總數是指在一定培養(yǎng)條件下每克（每毫升）檢樣中的細菌菌落總數。即食生制水產制品中菌落總數的國家限量標準為≤105 CFU/g（GB 10136—2015《食品安全國家標準 動物性水產制品》）。由圖1可知，經臭氧-ClO2處理后，魚糕的初始菌落總數較對照組降低0.6 （lg（CFU/g）），2 組魚糕的菌落總數均隨貯藏時間的延長而增加，對照組魚糕貯藏10 d后菌落總數迅速增加，貯藏20 d后菌落總數達到5.54 （lg（CFU/g）），超過國家限量標準（105 CFU/g）。而處理組魚糕貯藏10 d后菌落總數的增長趨勢明顯較緩，貯藏20 d后的菌落總數顯著低于對照組（P<0.05），隨著貯藏時間繼續(xù)延長，處理組魚糕菌落總數較對照組始終保持在較低水平，且貯藏25 d后仍未超出國家限量標準，貯藏30 d后菌落總數達到5.08 （lg（CFU/g）），略微超過國家限量標準。已有研究表明，ClO2和臭氧對魚肉有較好的減菌作用，ClO2和臭氧殺菌的可能機理主要有2 種：一是造成細胞膜通透性增加，導致細胞內鉀離子、鎂離子和ATP等小分子物質大量外泄[16];二是抑制蛋白質合成和導致酶失活[17-18]。

2.2 臭氧-ClO2處理對魚糕貯藏期間TVB-N含量的影響

TVB-N含量是表征魚類產品腐敗程度的一個重要指標。GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》要求貯藏期間淡水魚和蝦的TVB-N含量應≤20 mg/100 g。

由圖2可知，魚糕的初始TVB-N含量約為6 mg/100 g，隨著貯藏時間的延長，魚糕的TVB-N含量呈現上升趨勢。處理組與對照組魚糕貯藏前期（<10 d）的TVB-N含量變化相似，貯藏10 d后處理組魚糕的TVB-N含量增加速率明顯低于對照組，貯藏30 d后處理組魚糕TVB-N含量為20.04 mg/100 g，略高于國家限量標準（20 mg/100 g），而對照組魚糕貯藏25 d后的TVB-N含量已達到20.98 mg/100 g，超過國家限量標準。

以上結果表明，臭氧-ClO2能夠有效降低魚糕貯藏期間TVB-N含量的增加，貯藏后期作用更為明顯。TVB-N主要與微生物的生長和內源性蛋白酶的作用有關，田鑫等[19]在研究不同貯藏溫度、時間對南極磷蝦品質影響時發(fā)現，南極磷蝦品質下降（TVB-N含量、菌落總數上升）時，樣品中蛋白酶活力顯著下降。本研究結果也表明，TVB-N含量的變化與菌落總數的變化存在相關性，這表明臭氧-ClO2處理能夠抑制微生物的生長，同時還可能作用于蛋白質，使蛋白酶失活，從而有利于降低蛋白質的分解。

2.3 臭氧-ClO2處理對魚糕貯藏期間pH值的影響

正常的魚糕魚丸類水產制品在貯藏期內的pH值變化不明顯，一般維持在6.8～7.0。異常的pH值變化通常代表著微生物的大量增殖，例如，魚制品腐敗變質產生的典型終產物氨和三甲胺的大量積累會導致pH值升高[20]。

由圖3可知，貯藏初期（<15 d），2 組魚糕的pH值均在6.75～6.85波動，對照組魚糕貯藏15 d后pH值逐漸增加，這是由微生物的快速生長導致魚糕蛋白質分解產生大量堿性含氮化合物造成的[21]。而處理組魚糕的pH值始終維持在一個相對穩(wěn)定的范圍內（6.75～6.85），說明臭氧-ClO2處理能夠很好地抑制魚糕中微生物的增殖，從而使魚糕pH值維持在一個相對穩(wěn)定的范圍內。

2.4 臭氧-ClO2處理對魚糕貯藏期間持水力的影響

魚糕的持水力反映蛋白質與水的結合能力，常作為魚糕的品質評價指標之一。由圖4可知，2 組魚糕的持水力均隨著貯藏時間的延長而逐漸降低。貯藏前期（<10 d），2 組魚糕的持水力相當且下降相對緩慢;貯藏時間超過10 d后，2 組魚糕的持水力下降速率增加且開始出現明顯差異，其中對照組和處理組魚糕貯藏15 d后的持水力分別為69.92%和73.13%，貯藏30 d后的持水力分別為56.60%和68.41%，表明臭氧-ClO2處理有利于維持魚糕的持水性能。已有研究表明，魚糕凝膠網絡穩(wěn)定性的下降和其中水分流動性的增加是魚糕持水力下降的主要原因[22]。魚糕貯藏過程中，在內源酶和微生物的共同作用下，魚糕中的蛋白質發(fā)生降解，造成蛋白質網絡結構被破壞，魚糕持水性下降。而菌落總數測定結果表明，臭氧-ClO2處理能夠抑制微生物生長，從而減緩魚糕中蛋白質的降解，較好地保持魚糕凝膠的網絡結構，最終使處理組表現出更好的持水性。

2.5 臭氧-ClO2處理對魚糕貯藏期間白度的影響

白度是評價魚糜制品品質優(yōu)劣的指標之一。色澤是消費者選購商品時首先注意到的商品品質，較好的白度對于消費者選擇魚糕產品有積極作用。由圖5可知，魚糕白度整體上呈現緩慢下降趨勢，對照組魚糕的白度稍低于處理組，這可能與本研究條件下臭氧和ClO2的輕微漂白作用有關。因此，臭氧-ClO2處理對魚糕白度無明顯影響，可保持魚糕原有的產品色澤，這在消費者選購時有一定的積極作用。

2.6 臭氧-ClO2處理對魚糕貯藏期間質構的影響

質構數據可從多方面反映魚糕的物理性質。硬度是指魚糕保持原有形狀的內部結合力;彈性是指魚糕發(fā)生變形后恢復到原本形狀的能力;內聚性是指形成樣品形態(tài)所需內部結合力的大小，與樣品保持自身完整性能力相關;咀嚼性是指在咀嚼魚糕過程中需要的能量，反映了產品的柔軟度與口感[23]。

由圖6可知，貯藏5 d后，處理組魚糕的硬度顯著高于對照組，這可能是由于對照組魚糕在貯藏期內蛋白質降解導致魚糕凝膠網絡被破壞造成的，而臭氧-ClO2處理能夠減緩蛋白質的降解，從而使魚糕呈現更好的質構品質。在整個貯藏期間，2 組魚糕的內聚性和彈性均無明顯變化，說明魚糕的內聚性和彈性在貯藏期間能夠保持穩(wěn)定，且臭氧-ClO2處理對魚糕的內聚性和彈性無明顯影響。貯藏后期，對照組魚糕的咀嚼性明顯高于處理組，這可能是由于對照組魚糕持水性下降，導致魚糕水分含量降低，進而表現為咀嚼性升高。

彈性和硬度是消費者食用魚糕時最直接的口腔體驗，適中的硬度和良好的彈性能帶給消費者良好的食用體驗，臭氧-ClO2處理提高了魚糕的硬度并維持了魚糕貯藏期間的彈性，賦予消費者良好的感官體驗，這直接提高了產品商品化的可能性。

2.7 不同貯藏時間魚糕蛋白的SDS-PAGE分析

草魚魚肉的肌原纖維蛋白是一個比較復雜的蛋白體系，在SDS-PAGE中呈現的明顯條帶分別為肌球蛋白重鏈（220 kDa）、肌動蛋白（44.3 kDa）、原肌球蛋白（37 kDa）、肌原蛋白（33 kDa）和肌球蛋白輕鏈（15、17、24 kDa），其中肌球蛋白重鏈和肌動蛋白是最主要的蛋白條帶[24]。

肌球蛋白重鏈的分解是魚肉蛋白質網狀結構被破壞的重要原因之一[25]。由圖7可知，隨著貯藏時間的延長，對照組魚糕蛋白的肌球蛋白重鏈條帶出現一定程度的變淺，尤其是在貯藏后期（30 d），其肌球蛋白重鏈條帶已經明顯淺于貯藏初期（<5 d），說明魚糕肌原纖維蛋白在貯藏過程中發(fā)生降解，這可能是由于貯藏過程中內源性酶降解魚肉蛋白導致的。而處理組魚糕肌球蛋白重鏈條帶未出現明顯變淺的現象，說明臭氧-ClO2處理能夠延緩魚糕肌原纖維蛋白的降解，這可能與臭氧-ClO2處理對魚肉中內源酶活性的抑制作用有關。Benarde等[26]研究大腸桿菌的細胞壁和蛋白質合成過程中ClO2的影響，結果表明，ClO2處理不會引起細菌細胞內容物的外滲，說明ClO2沒有破壞細胞壁;但是其蛋白質合成過程卻被明顯抑制，表明ClO2抑制了內源酶的活性。此外，李瑋[27]研究不同質量濃度臭氧對白鰱魚糜中組織蛋白酶活性的影響，結果表明，當臭氧質量濃度達到1.5 mg/L時，樣品中組織蛋白酶活性被明顯抑制。這可能是由于臭氧的強氧化性使組織蛋白酶分子中的部分活性基團被氧化，從而導致酶活性被抑制[28]。

3 結 論

經過0.65 mg/L臭氧水溶液和10 mg/L ClO2處理后，草魚魚糕貯藏期間的微生物生長被顯著抑制，TVB-N含量上升減緩，保質期顯著延長，冷藏25 d仍未超過國家相應限量標準，將真空包裝草魚魚糕的貯藏期延長10 d。同時臭氧水溶液和ClO2溶液聯合處理能夠提高草魚魚糕的持水性，減緩草魚魚糕的白度下降，改善質構品質。菌落總數及TVB-N含量測定結果表明，臭氧-ClO2處理能夠抑制草魚魚糕中微生物的生長，從而延長草魚魚糕的保質期。SDS-PAGE結果表明，臭氧-ClO2處理能夠延緩草魚魚糕肌原纖維蛋白的降解，這可能與臭氧-ClO2處理對魚肉中內源酶活性的抑制作用有關。

在傳統(tǒng)魚糕制備工藝基礎上對草魚魚糕進行臭氧-ClO2處理能夠延長魚糕保質期，改善魚糕持水特性，同時不破壞魚糕原有的質構特性和白度，本研究結論對魚糕加工、延長魚糕貨架期及促進魚糕產業(yè)化具有一定的科學意義和實際價值。

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