王鈺婷 ，劉錦燕，史 冊(cè)，趙珺濤 ，項(xiàng)明潔

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科，上海 200020

白念珠菌是臨床上最常見(jiàn)的條件致病性真菌，可存在于人體的皮膚、口腔、胃腸道、陰道等部位。一般情況下，該菌在正常機(jī)體中數(shù)量較少，不會(huì)引起疾病。當(dāng)人體免疫力低下時(shí)，其可轉(zhuǎn)換成致病菌引起表淺感染，嚴(yán)重時(shí)則可引發(fā)危及患者生命的念珠菌血癥[1-2]。近年來(lái)，廣譜抗生素的濫用以及免疫功能缺陷患者的不斷增多致使臨床念珠菌的感染率和死亡率呈上升趨勢(shì)，其中以白念珠菌感染最常見(jiàn)[3-4]。

臨床上用于治療白念珠菌的常用藥物有多烯類(lèi)、唑類(lèi)、嘧啶類(lèi)和棘白菌素類(lèi)等，其中三唑類(lèi)藥物[如氟康唑（fluconazole，F(xiàn)CZ）、伏立康唑（voriconazole，VRC）、伊曲康唑（itraconazole，ITR）]因其抗菌譜廣、療效顯著、生物利用度高和毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，常作為臨床治療中的一線(xiàn)用藥。唑類(lèi)藥物的抑菌機(jī)制是其可作用于白念珠菌細(xì)胞膜麥角固醇合成中的關(guān)鍵酶，使白念珠菌細(xì)胞膜甾醇合成通路受阻、細(xì)胞膜完整性破壞及菌體內(nèi)有毒的甲基化固醇類(lèi)物質(zhì)累積而達(dá)到抗真菌作用[5]。然而，在臨床頻繁的預(yù)防經(jīng)驗(yàn)用藥中，耐藥性的產(chǎn)生給該類(lèi)藥物的應(yīng)用帶來(lái)很大困難[5-6]。

甾醇合成通路改變主要是由△5,6- 去飽和酶的失活引起，該酶由ERG3（Ergosterol 3）基因編碼[7]。唑類(lèi)藥物通過(guò)抑制14α- 去甲基化酶（14α-demethylase，14-DM）發(fā)揮抑菌作用，當(dāng)ERG3發(fā)生突變或缺失后就不能編碼有活性的△5,6- 去飽和酶，致使中間積聚的產(chǎn)物變成14α- 甲基法尼醇，它可以代替部分麥角固醇的功能，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繼而導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生。

本研究在Noble等[8]提出的構(gòu)建白念珠菌基因敲除株策略基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，高效獲得白念珠菌ERG3基因敲除株，并就ERG3敲除對(duì)白念珠菌唑類(lèi)藥物耐藥性及其常見(jiàn)耐藥基因的表達(dá)進(jìn)行分析，以期為深入研究白念珠菌的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象、引物及試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 藥敏標(biāo)準(zhǔn)白念珠菌ATCC90028由本實(shí)驗(yàn)室保存，DH5α大腸埃希菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中涉及的其他白念珠菌菌株和質(zhì)粒信息見(jiàn)表1。其中，質(zhì)粒pSN40含有亮氨酸（leucine 2，LEU2）篩選標(biāo)記，質(zhì)粒pSN52含有組氨酸（histidine 1，HIS1）篩選標(biāo)記。

表1 白念珠菌菌株和質(zhì)粒Tab 1 Candida albicans strains and plasmids

1.1.2 引物 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列及合成片段見(jiàn)表2～4。

表2 敲除引物序列Tab 2 Primer sequences for knockout

表3 鑒定敲除組件的引物序列Tab 3 Primer sequences for identification of knockout components

表4 耐藥基因的引物序列Tab 4 Primer sequences for drug resistance

1.1.3 試 劑 Ex Taq酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、酵母總RNA提取試劑盒（Yeast RNAiso Kit）、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Enzyme）等購(gòu)自日本TaKaRa公司，藥物（FCZ、VRC、ITR）及配置YPD培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基所需蛋白胨、酵母浸液、葡萄糖等購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選培養(yǎng)基SD-HIS、SD-LEU和醋酸鋰轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自北京泛基諾科技有限公司，配置藥敏板的RPMI 1640培養(yǎng)基和3-嗎啉丙磺酸（3-Morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）粉末購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇、酚/氯仿/異戊醇（24:24:1）等購(gòu)自上海試劑一廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白念珠菌基因組抽提 參照李文靜等[9]和王影等[10]報(bào)道的方法對(duì)白念珠菌基因組進(jìn)行抽提。挑取白念珠菌SN152的單克隆于3 mL YPD培養(yǎng)液，于30 ℃ 180×g振蕩培養(yǎng)16 h，13 000×g離心2 min收集菌體。加入酵母裂解液（10%十二烷基硫酸鈉、0.5 mmol/L pH 8.0 乙二胺四乙酸蛋白酶K）后，水浴65 ℃ 2 h。加入0.5 mL酚/氯仿/異戊醇（24:24:1）混勻，于13 000×g4 ℃離心5 min。吸取上清液轉(zhuǎn)至新的離心管，加入等體積氯仿，混勻后離心。轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，加入0.6倍體積異丙醇，充分混勻后離心。棄去上清液，沉淀用0.5 mL 75% 乙醇洗滌并離心。棄上清，室溫下充分干燥，加入50 μL滅菌去離子水溶解。DNA采用超微量分光光度儀（Thermo Nanodrop 2000）進(jìn)行定量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與抽提 參照李文靜等[9]和王影等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與抽提。采用氯化鈣法將質(zhì)粒pSN40和pSN52轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α內(nèi)，將菌液密涂于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上于37 ℃過(guò)夜孵育。挑取該平板上的單克隆接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 180×g過(guò)夜培養(yǎng)，參照柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提質(zhì)粒。

1.2.3 構(gòu)建同源敲除組件 以SN152 菌株DNA為模板，P1/P1'和P3/P3'為引物擴(kuò)增ERG3基因編碼區(qū)上游片段UP-1/UP-2，P4/P4'和P6/P6'擴(kuò)增下游片段DOWN-1/DOWN-2。以pSN40和pSN52質(zhì)粒為模板，P2和P5為引物擴(kuò)增篩選標(biāo)記LEU和HIS片段（圖1A）。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，并根據(jù)PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化回收。

以純化后的上述PCR產(chǎn)物[上游片段UP-1/UP-2（50 ng）+篩選標(biāo)記LEU或HIS片段（150 ng）+下游片段 DOWN-1/DOWN-2（50 ng）]為模板，P1/P1'和 P6/P6'為引物進(jìn)行融合PCR反應(yīng)，分別得到同源敲除組件UP-1-LEU-DOWN-1、UP-2-HIS-DOWN-2，前者用以第1拷貝敲除而后者用以第2拷貝敲除（圖1B）。融合PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，68 ℃ 8 min（30個(gè)循環(huán)）；68 ℃ 15 min。融合PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀法回收，-20 ℃保存?zhèn)溆?。融合片段即同源敲除組件送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序，并使用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，證實(shí)序列的正確性。

圖1 構(gòu)建同源敲除組件Fig 1 Construction of homologous knockout fragments

1.2.4 目的基因ERG3敲除株的構(gòu)建與鑒定 按照醋酸鋰轉(zhuǎn)染法[11]將第1拷貝敲除組件UP-1-LEU-DOWN-1轉(zhuǎn)染到SN152菌株。在SD-LEU選擇平板上培養(yǎng)48 h，挑單克隆于YPD培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，抽提基因組DNA。采用套式PCR鑒定，得到ERG3+/-菌株（圖2）。LEU上下游片段分別位于P1、P3的上游和下游，引物L(fēng)EU上下游片段位于LEU標(biāo)記的內(nèi)部，可鑒定第1拷貝敲除組件是否正確插入目的基因的所在位置（圖3）。經(jīng)套式PCR鑒定正確的ERG3+/-菌株，用于轉(zhuǎn)染第2拷貝敲除組件UP-2-HISDOWN-2，菌液密涂于SD-LEU、SD-HIS、SD-LEU-HIS選擇性培養(yǎng)基上，其余步驟及套式PCR鑒定原理同上。引物ERG3-F和ERG3-R用于鑒定目的基因是否被完全敲除。

圖2 運(yùn)用同源重組技術(shù)敲除ERG3基因Fig 2 ERG3 gene knocked out by homologous recombination

圖3 ERG3陽(yáng)性敲除菌株的鑒定Fig 3 Identification of positive ERG3 gene knockout strains

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）M27-A3相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，使用微量肉湯稀釋法確定白念珠菌對(duì)FCZ、VRC、ITR的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。96孔板中，使得FCZ、VRC、ITR的最高終濃度分別為128、32、16 μg/mL，并依次對(duì)倍稀釋。結(jié)果判讀參照NCCLS抗真菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，判定敏感（susceptible，S）、中介（intermediate，I）、耐藥（resistance，R）3種結(jié)果。FCZ MIC≤8 μg/mL為敏感，MIC=16～32 μg/mL為中介，MIC≥64 μg/mL為耐藥。VRC MIC≤1 μg/mL為敏感，MIC=2 μg/mL為中介，MIC≥4 μg/mL為耐藥。ITR MIC≤0.125 μg/mL為敏感，MIC=0.25～0.5 μg/mL為中介，MIC≥1.0 μg/mL為耐藥。

1.2.6 耐藥相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè) 按照酵母總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取SN152、ERG3+/-和ERG3-/-菌株的總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)抽提的總RNA進(jìn)行去基因組和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq酶試劑盒對(duì)3株菌株的cDNA行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime quantitative PCR，qPCR）檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min（40個(gè)循環(huán)）。溶解曲線(xiàn)反應(yīng)為：95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。引物序列見(jiàn)表 4。每個(gè)菌株均做復(fù)孔，重復(fù)3次，以18S RNA為內(nèi)參基因，應(yīng)用ABI 7300 SDS軟件系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，CT值通過(guò)2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERG3基因缺失菌構(gòu)建成功

白念珠菌SN152僅能在YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；第1拷貝敲除株ERG3+/-可在YPD培養(yǎng)基和SD-LEU營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；雙敲除菌株ERG3-/-在YPD、SD-LEU、SD-HIS和SD-LEU-HIS缺陷培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)（圖4）。繼而說(shuō)明LEU和HIS篩選標(biāo)記已成功轉(zhuǎn)入SN152菌株并表達(dá)。

圖4 菌株?duì)I養(yǎng)型鑒定Fig 4 Identification of nutritional type in strains

為了進(jìn)一步驗(yàn)證敲除組件是否正確插入目的基因所在位置，需采用套式PCR進(jìn)行驗(yàn)證。利用LEU上下游引物擴(kuò)增出LEU上下游片段，長(zhǎng)度分別為1 009 bp和1 155 bp；利用HIS上下游引物擴(kuò)增出HIS上下游片段，長(zhǎng)度分別為1 214 bp和1 906 bp。經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，各篩選標(biāo)記已轉(zhuǎn)入親本菌基因組序列的正確位置，目的條帶與預(yù)期一致。ERG3雙敲株的4個(gè)鑒定片段（LEU上下游片段、HIS上下游片段）均在預(yù)期位置且目的基因ERG3位置無(wú)條帶出現(xiàn)；而親本菌SN152只有ERG3片段（454 bp）、無(wú)4個(gè)鑒定片段（圖5）。由此提示，ERG3基因敲除成功。

圖5 PCR驗(yàn)證ERG3基因敲除株Fig 5 Identification of ERG3 gene knockout strains by PCR

2.2 ERG3基因敲除對(duì)白念珠菌唑類(lèi)藥物耐藥性的影響

用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC90028作為對(duì)照，比較野生型菌株SN152、單拷貝缺失株（ERG3+/-）、雙拷貝缺失株（ERG3-/-）對(duì)唑類(lèi)藥物敏感性的變化。前述菌株對(duì)FCZ、VRC、ITR的MIC值顯示，ERG3+/-株與野生型SN152菌株均表現(xiàn)出對(duì)以上3種唑類(lèi)藥物一致的敏感。ERG3-/-株的MIC值明顯高于ERG3+/-株和SN152菌株；且當(dāng)ERG3基因被敲除后，白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性增強(qiáng)，即由敏感轉(zhuǎn)為耐藥（表5）。

表5 各菌株對(duì)FCZ、VRC、ITR的MIC值Tab 5 MIC values of FCZ, VRC and ITR in different Candida albicans strains

2.3 ERG3+/-株耐藥基因水平的變化

在白念珠菌唑類(lèi)藥物耐藥機(jī)制中，除了由ERG3基因編碼的△5,6- 去飽和酶參與的甾醇合成通路改變之外，藥物外排增加和唑類(lèi)藥物靶酶的改變也是常見(jiàn)原因。介導(dǎo)白念珠菌藥物外排的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要有2類(lèi)：一種是ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，其中最重要的是CDR1p（Candida albicansdrug resistance protein 1）和CDR2p，分別由白念珠菌耐藥基因CDR1和CDR2編碼，它們通過(guò)水解ATP釋放能量將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞[12]；另一種是易化擴(kuò)散載體超家族（major facilitator superfamily，MFS）， 其 中 MDR1p（multidrug-resistance protein 1）由多藥耐藥基因MDR1編碼，它不依賴(lài)于水解ATP的能量，而是通過(guò)細(xì)胞膜中氫離子的交換達(dá)到轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的目的[13]。此外，14-DM是由ERG11基因編碼產(chǎn)生的唑類(lèi)藥物的靶酶。若ERG11基因發(fā)生突變或者過(guò)表達(dá)時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致白念珠菌產(chǎn)生耐藥性[14-15]。當(dāng)ERG11發(fā)生突變，會(huì)影響14-DM的空間構(gòu)象，使得藥物與靶酶結(jié)合的親合力降低；當(dāng)ERG11過(guò)表達(dá)，藥物作用靶酶量增多，導(dǎo)致同等藥量下，未被藥物結(jié)合的靶酶量也相應(yīng)增高，藥物不能達(dá)到預(yù)期的抗菌效果，從而產(chǎn)生耐藥。因此為了探究ERG3基因敲除是否也與白念珠菌其他耐藥機(jī)制相關(guān)，故采用qPCR檢測(cè)各菌株中前述耐藥基因（CDR1、CDR2、MDR1、ERG11）的表達(dá)情況，以SN152作為對(duì)照（圖6）。結(jié)果顯示，與SN152相比，ERG3+/-株的CDR1（2.05倍）表達(dá)上升，但CDR2、MDR1和ERG11無(wú)顯著變化；而ERG3-/-株的CDR1（2.63倍）、CDR2（18.47倍）、MDR1（3.72倍）、ERG11（51.71倍）表達(dá)均顯著上升，尤以ERG11的上調(diào)最為顯著。由此可見(jiàn)，ERG3基因敲除的同時(shí)伴隨著其他耐藥基因的高表達(dá)。

圖6 各菌株耐藥相關(guān)基因的表達(dá)Fig 6 Expression of drug resistance-related genes in the three strains

3 討論

基因敲除技術(shù)是研究白念珠菌基因功能的重要方法。經(jīng)典的白念珠菌基因敲除方法為URA-Blaster策略，該方法以基因同源重組為基礎(chǔ)，通過(guò)連續(xù)2次的hisG-URA3-hisG敲除篩選組件替代靶基因的2個(gè)等位基因，從而阻斷靶基因的功能[16-17]。URA-Blaster策略是最早用到營(yíng)養(yǎng)篩選的白念珠菌基因敲除的方法，但此法需要構(gòu)建重組質(zhì)粒，敲除效率低、周期長(zhǎng)；而且有研究[18-19]表明，乳清苷5- 磷酸脫羧酶（URA3基因編碼）缺失的白念珠菌生長(zhǎng)緩慢，即使在基因敲除過(guò)程中可將URA3基因恢復(fù)，也同樣會(huì)影響菌株的毒力、黏附及形態(tài)轉(zhuǎn)換等性質(zhì)。2005年Noble等[8]構(gòu)建了不依賴(lài)URA3的HIS1-LEU2-ARG4基因敲除策略，該方法以SN152為親本菌，HIS1、LEU2、ARG4是異源的篩選標(biāo)記，可任意選擇2個(gè)標(biāo)記進(jìn)行基因敲除。本實(shí)驗(yàn)所采用的HIS1-LEU2策略回避了URA3對(duì)白念珠菌毒力的影響，且具有周期短、轉(zhuǎn)染效率高等特點(diǎn)[20-21]。此外，Noble等[8]構(gòu)建的2條基因敲除組件上游和下游同源臂（即UP和DOWN）均為350 bp，存在第1條敲除組件被第2條敲除組件所替換的可能性，導(dǎo)致敲除效率降低。本研究在Noble等[8]的方法基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)，即UP-1為359 bp、DOWN-1為 470 bp、UP-2為 354 bp、DOWN-2為393 bp，第2條敲除組件的上下游同源臂均短于第1條敲除組件的同源臂，因此可有效避免被替換的情況。

白念珠菌是臨床上常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病性真菌，唑類(lèi)藥物常作為臨床治療中的一線(xiàn)用藥；然而，近年來(lái)白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性日益嚴(yán)重，已成為治療失敗的主要原因之一[22]。白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物存在多種耐藥機(jī)制，其中甾醇合成通路的變化主要是因?yàn)椤?,6-脫氫酶失活而引起，從而使唑類(lèi)藥物的作用減弱。Martel等[23]的研究顯示，ERG3的錯(cuò)義突變可以引起白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的高度耐藥性，部分突變菌株甚至在FK506（一種多藥物外排抑制劑）存在的情況下仍體現(xiàn)出唑類(lèi)耐藥表型。Vale-Silva等[24]在臨床上篩到了一株分離株（VSY2），測(cè)序顯示該菌株ERG3雙堿基缺失導(dǎo)致△5,6- 脫氫酶失活，該菌株對(duì)唑類(lèi)藥物具有高耐藥性，缺乏麥角甾醇但絲狀結(jié)構(gòu)正常。由此可見(jiàn)，白念珠菌ERG3的突變或缺失對(duì)于其唑類(lèi)藥物耐藥性有著重要意義。

在本研究中，我們使用同源重組和LEU-HIS標(biāo)記篩選的方法獲得了白念珠菌ERG3缺失株。ERG3-/-株對(duì)3種唑類(lèi)藥物的MIC值明顯高于親本株SN152和ERG3+/-株，說(shuō)明只有當(dāng)ERG3被完全敲除時(shí)，白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥性才會(huì)升高，ERG3單條基因的缺失不足以引起耐藥性的改變，該耐藥性結(jié)果與Luna-Tapia等[25]采用URA-Blaster策略獲得的ERG3缺失株結(jié)果一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)ERG3基因敲除的同時(shí)也伴隨著其他耐藥基因的改變。qPCR結(jié)果顯示，ERG3-/-株的CDR1、CDR2、MDR1、ERG11基因表達(dá)水平均顯著上升；而ERG3+/-株除了CDR1基因表達(dá)有上升外，其余3個(gè)耐藥基因未顯示出差異。ERG3-/-和ERG3+/-菌株耐藥基因的結(jié)果和藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在一定的一致性。CDR1、CDR2、MDR1是與外排泵編碼相關(guān)的基因，這些基因的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物外排，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低從而導(dǎo)致耐藥。而在ERG3-/-株中上升最為顯著的是ERG11（51.71倍），ERG11所編碼的羊毛甾醇14-DM是唑類(lèi)藥物的作用靶酶，若ERG11基因過(guò)表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致菌株耐藥。本研究證實(shí)了ERG3-/-株中的外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1和藥物靶酶編碼基因ERG11的高表達(dá)，從基因水平提示ERG3基因的缺失除了導(dǎo)致白念珠菌甾醇合成通路改變，或也伴隨著其他耐藥機(jī)制的發(fā)生。后續(xù)可深入檢測(cè)ERG3敲除帶來(lái)的功能變化，即檢測(cè)ERG3-/-株羅丹明6G外排情況和14-DM的活性，從而進(jìn)一步明確ERG3敲除與菌株藥物外排的能力和藥物靶酶變化的聯(lián)系。同時(shí)，ERG3基因是如何參與介導(dǎo)白念珠菌對(duì)其他唑類(lèi)藥物耐藥機(jī)制也仍待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功利用同源重組的方法構(gòu)建了白念珠菌ERG3基因缺失菌，并對(duì)其唑類(lèi)藥物耐藥性之間的關(guān)系進(jìn)行了初步探究，揭示了在白念珠菌中敲除ERG3基因可提高菌株唑類(lèi)藥物的耐藥性，為進(jìn)一步研究ERG3基因與白念珠菌多種耐藥機(jī)制之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。