林 礪，李海波，夏 凡，周計(jì)雪，郭曉奎#，張舒林, #

1. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025；2.上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；3.中國(guó)人民解放軍第905醫(yī)院肺科，上海 200235

結(jié)核?。╰uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，Mtc）感染引起的一類(lèi)以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染性疾病，好發(fā)于全身各個(gè)部位，如肺、腸和骨等[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)， 2018年全球新增約1 000萬(wàn)人感染結(jié)核病，死亡人數(shù)約120萬(wàn)，其中約25萬(wàn)人死于結(jié)核和人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的雙重感染[2]。MicroRNAs（miRNAs）是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中的小的單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸；其經(jīng)轉(zhuǎn)錄及剪切后可直接結(jié)合靶基因的mRNA抑制基因的表達(dá)，從而參與基因的調(diào)控[3-4]。許多研究[5]表明miRNAs在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，有望成為預(yù)測(cè)疾病發(fā)生與發(fā)展甚至預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，因此近年來(lái)對(duì)該領(lǐng)域的研究獲得了極大的關(guān)注。外泌體是一類(lèi)直徑為30～150 nm的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡[6]，各種細(xì)胞均可以分泌。由于外泌體復(fù)雜的生物形成過(guò)程，其內(nèi)含有多種生物分子，包括四跨膜蛋白（如CD63、CD81、CD82、CD53）、膜蛋白、多囊泡體（multivesicular bodies，MVB）生物發(fā)生相關(guān)蛋白（如腫瘤易感基因101蛋白）、細(xì)胞來(lái)源的特定蛋白質(zhì)標(biāo)志物、脂質(zhì)、不同種類(lèi)RNA（如mRNA、miRNA）以及DNA[7-9]。外泌體攜帶的豐富的生物分子不僅為其鑒定提供了依據(jù)，也有望成為重要的生物標(biāo)志物，從而為疾病的診斷及進(jìn)一步研究提供了可能。本研究利用超速離心的方法獲取外泌體，基于細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行臨床樣本驗(yàn)證，為結(jié)核病的臨床診斷提供潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)也為結(jié)核病的機(jī)制研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象、主要試劑及儀器

1.1.1 入組對(duì)象 10例結(jié)核病患者（結(jié)核病組）均來(lái)自中國(guó)人民解放軍第905醫(yī)院肺科，8例志愿者（健康對(duì)照組）均為健康體檢者。結(jié)核病組的納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷為初治結(jié)核。②年齡為18～65周歲。③痰涂片或液體培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性。④無(wú)并發(fā)糖尿病、艾滋病等疾病以及自身免疫性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已用藥治療后的初治結(jié)核患者。②有傳染性疾病或基礎(chǔ)性疾病以及肺癌等肺部相關(guān)疾病者。

健康對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為18～65周歲。② 體檢正常，無(wú)肝功能、腎功能異常以及心血管疾病。③ 體檢胸片無(wú)異常。④無(wú)傳染性疾病、基礎(chǔ)代謝性疾病以及自身免疫性疾病。⑤近3個(gè)月無(wú)用藥史。

本研究已獲得臨床患者和健康志愿者知情同意并通過(guò)了倫理審批。所有入組對(duì)象的基本資料見(jiàn)表1。

表1 結(jié)核病組和健康對(duì)照組的基本資料Tab 1 General information of the tuberculosis group and the healthy control group

1.1.2 菌株與細(xì)胞系 卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG，即減毒牛分枝結(jié)核桿菌）菌株來(lái)源于美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)（American Tissue Culture Collection，ATCC）。人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1）購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（ScienCell，美國(guó)），β- 巰基乙醇（Amresco，美國(guó)），7H9培養(yǎng)基（BD，美國(guó)），油酸、白蛋白、右旋糖和過(guò)氧化氫酶培養(yǎng)基（oleic acid，albumin，dextrose and catalase medium，OADC）增菌液（Solarbio，美國(guó)），佛波醇（phorbol myristate acetate，PMA）（Sigma，美國(guó)），TSG-101、CD-9、β- 肌動(dòng)蛋白（β-actin）單抗（Abcam，美國(guó)），羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（上海翊圣生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（Thermo，美國(guó)），TRIzol試劑（Invitrogen，美國(guó)），氯仿、異丙醇和無(wú)水乙醇（上海試一化學(xué)試劑有限公司），磷鎢酸負(fù)染色液（2%）（Solarbio，美國(guó)），SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，美國(guó)），qPCR SYBR Green 預(yù)混液（上海云序生物科技有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床樣本的采集及處理 分別采集結(jié)核病組患者和健康對(duì)照組志愿者外周血5 mL，向其中加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝血。于標(biāo)本采集6 h內(nèi)進(jìn)行4 ℃、2 000×g離心15 min獲得上清液即為血漿，再用無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管進(jìn)行分裝，-80 ℃保存待用。

1.2.2 BCG菌株培養(yǎng) 配制7H9液體培養(yǎng)基，加入終濃度為0.2%甘油，于高壓滅菌后按1:10加入OADC增菌液。使用前，加入終濃度為0.05%的過(guò)濾消毒吐溫 -80。將-20 ℃甘油保種的BCG菌株接種到液體培養(yǎng)基中，并置于37 ℃搖床上培養(yǎng)[10]。

1.2.3 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 復(fù)蘇凍存的THP-1細(xì)胞。用去除外泌體的FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基、β-巰基乙醇（比例為100:900:1）配制培養(yǎng)液，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，每3 d傳代1次。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，于10 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行鋪板，每培養(yǎng)皿保證10 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，并用200 nmol/L 的 PMA處理細(xì)胞24 h，使THP-1分化成貼壁的巨噬細(xì)胞（mTHP-1）[10-12]。

1.2.4 BCG菌株感染mTHP-1細(xì)胞 誘導(dǎo)結(jié)束后，用BCG菌株感染mTHP-1細(xì)胞（感染復(fù)數(shù)為1:10）記為感染組，對(duì)不做處理的未感染mTHP-1細(xì)胞記為對(duì)照組。感染4 h后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗出未進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組做同樣處理，72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液[12]。

1.2.5 外泌體獲取 按照Théry等[13]的方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和血漿中的外泌體進(jìn)行獲取。于4 ℃ 2 000×g下超速離心10 min棄去殘留細(xì)胞、碎片，取上清液于4 ℃12 000×g下離心30 min進(jìn)一步棄去沉淀中的碎片，再次取上清液于4 ℃ 110 000×g下離心120 min保留含外泌體的沉淀；用無(wú)菌PBS重懸后于0.22 μm的濾器除去較大囊泡體，于4 ℃ 110 000×g下離心70 min，保留含外泌體的沉淀；再用無(wú)菌PBS重懸后于-80 ℃保存。

1.2.6 外泌體形態(tài)鑒定 先將獲取的外泌體溶液滴加到碳覆膜銅網(wǎng)中心，待樣品吸附后用濾紙吸去多余液體并置于紅外燈下烘干。用2%多聚甲醛固定外泌體，用2%磷鎢酸負(fù)染，于透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（80kV）下觀察并拍照[13]。

1.2.7 外泌體標(biāo)志蛋白檢測(cè) 用新鮮配制的含有苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的 RIPA裂解液對(duì)外泌體進(jìn)行裂解，獲取總蛋白。再用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度（按照說(shuō)明書(shū)操作）后，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)。于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)至甲醛活化的聚偏二氟乙烯膜上，于4 ℃下用脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（CD9、TSG101，工作濃度分別為1:1 000、1:500），室溫下孵育2 h，TBST洗脫3次后加入二抗，室溫下孵育1 h，再用TBST洗脫3次，顯影并拍照[13]。

1.2.8 總RNA提取 將-80 ℃保存的外泌體溶液冰上溶解，加入TRIzol試劑1 mL，室溫靜置5 min充分裂解細(xì)胞；加入200 μL氯仿，震蕩混勻15 s，室溫放置5 min，分離蛋白和RNA；于4 ℃下12 000×g離心15 min，小心分離含RNA的無(wú)色相；加入0.5 mL異丙醇沉淀RNA，室溫靜置10 min；于4℃下12 000×g離心10 min棄去上清，用75%乙醇清洗RNA沉淀；于4 ℃下7 500×g離心5 min棄去液體，室溫干燥5～10 min；RNase-free水溶解RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 miRNA的測(cè)序分析 將-80 ℃保存的來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)上清外泌體的總RNA送至上海云序生物科技有限公司進(jìn)行miRNA的測(cè)序分析。

1.2.10 臨床樣本miRNA檢測(cè) 選擇測(cè)序結(jié)果中幾個(gè)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行臨床樣本驗(yàn)證。將-80 ℃保存的臨床樣本RNA通過(guò)特異性引物反轉(zhuǎn)成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，引物序列見(jiàn)表2。利用SYBR Green的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）。PCR 反應(yīng)步驟：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表3。目的miRNA的表達(dá)量用U6進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，相對(duì)表達(dá)水平用2-△△CT的方法進(jìn)行計(jì)算。

表2 反轉(zhuǎn)錄引物序列Tab 2 Primer sequences for reverse transcription

表3 qPCR引物序列Tab 3 Primer sequences for qPCR

1.2.11 miRNA-323a-3p的靶基因預(yù)測(cè) 利用TargetScan、miRDB和PicTar數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA-323a-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并繪制Venn圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)以±s表示。采用非配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)核病組與健康對(duì)照組進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)和感染的形態(tài)變化

機(jī)體抗結(jié)核感染是以T細(xì)胞為介導(dǎo)、以巨噬細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的免疫過(guò)程，結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞是最常見(jiàn)的體外研究結(jié)核感染的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。小鼠?lái)源的巨噬細(xì)胞系RAw264.7因具有易傳代培養(yǎng)且生物學(xué)行為穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，常被用作該模型的細(xì)胞來(lái)源；但由于物種的差異，來(lái)自RAw264.7的實(shí)驗(yàn)結(jié)論并不能真實(shí)反映人源巨噬細(xì)胞的情況。人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1可以經(jīng)體外PMA誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞，更能準(zhǔn)確反映真實(shí)結(jié)核菌感染人體的情況，故而THP-1成為了用于體外研究炎癥相關(guān)巨噬細(xì)胞功能的經(jīng)典細(xì)胞模型[14-15]。本研究通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)不同階段的THP-1細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，THP-1細(xì)胞呈圓形、均勻、透亮懸浮狀態(tài)（圖1A）；經(jīng)PMA誘導(dǎo)成貼壁巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，亦出現(xiàn)偽足（圖1B）；經(jīng)BCG感染后，細(xì)胞因?yàn)橥淌杉?xì)菌而聚集，且具有典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)變化特點(diǎn)（圖1C）。

圖1 不同因素誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞形態(tài)（×40）Fig 1 Morphology of THP-1 cell induced by different factors (×40)

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液及血漿來(lái)源的外泌體的形態(tài)鑒定

采用TEM對(duì)超速離心后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液以及血漿來(lái)源的外泌體（30～150 nm）進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示鏡下可見(jiàn)大小約100 nm、有明顯的膜結(jié)構(gòu)以及圓盤(pán)形狀的囊泡，且均具有典型的外泌體結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 外泌體的TEM觀察Fig 2 TEM image of exosomes

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液及血漿來(lái)源的外泌體的表面標(biāo)志物表達(dá)

外泌體內(nèi)含有多種特異性蛋白，如CD81、CD63、CD9、TSG101等。本研究采用Western blotting對(duì)外泌體特異性蛋白CD9及TSG101進(jìn)行驗(yàn)證，以β-actin作為內(nèi)參。通過(guò)對(duì)超速離心法獲取的沉淀進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外泌體特征性蛋白高表達(dá)，同時(shí)也進(jìn)一步說(shuō)明所提取樣本為外泌體（圖3）。

圖3 Western blotting檢測(cè)外泌體特異性標(biāo)志蛋白CD9和TSG101的表達(dá)Fig 3 Expression of exosome-specific markers CD9 and TSG101 by Western blotting

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液外泌體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液外泌體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，根據(jù)reads≥10、fold change值≥2或≤0.5對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)做進(jìn)一步處理，并對(duì)BCG組與對(duì)照組外泌體來(lái)源的miRNA轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，具體差異表達(dá)的miRNA見(jiàn)圖4。

2.5 臨床血漿樣本的qPCR驗(yàn)證

基于上述2.4處理獲得的差異表達(dá)譜數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，結(jié)合測(cè)序結(jié)果中的reads讀數(shù)大小，最終挑選出3個(gè)差異表達(dá)的miRNA即miRNA-29a-3p、miRNA-29b-3p和miR-323a-3p進(jìn)行qPCR臨床驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)圖5。與健康對(duì)照組相比，僅miR-323a-3p在結(jié)核病組的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)（P=0.004），與測(cè)序結(jié)果一致（圖4）；miRNA-29a-3p（P=0.505）和 miRNA-29b-3p（P=0.644）的改變均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖5 結(jié)核病組患者與健康對(duì)照組志愿者的血漿樣本qPCR驗(yàn)證結(jié)果Fig 5 qPCR verification results of plasma samples in the two groups

2.6 miRNA-323a-3p的下游靶基因預(yù)測(cè)

基于miRNA-323a-3p在細(xì)胞培養(yǎng)上清液外泌體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和臨床血漿樣本qPCR驗(yàn)證結(jié)果中出現(xiàn)一致性，故對(duì)其進(jìn)行下游靶基因分析。利用TargetScan、miRDB和PicTar數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA-323a-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并繪制Venn圖（圖6），結(jié)果顯示共有8個(gè)共同靶基因，即為絲氨酸/蘇氨酸激酶類(lèi) UNC-51-激酶2（unc-51 like autophagy activating kinase 2，ULK2）、SMG P21 刺激GDP/GTP 交換蛋白（Rap1 GTPase-GDP dissociation stimulator 1，RAP1GDS1）、Nik相關(guān)激酶（Nik related kinase，NRK）、小泛素相關(guān)修飾蛋白1（small ubiquitin like modifier 1，SUMO1）、POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族2（POU class 4 homeobox 2，POU4F2）、蛋白基質(zhì)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B，CDKN1B）、GTP酶激活蛋白SH3功能結(jié)合蛋白2（G3BP stress granule assembly factor 2，G3BP2）和細(xì)胞質(zhì)多腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，CPEB4）；其中，ULK2屬于ULK家族，而ULK家族在自噬途徑中扮演著重要作用，同時(shí)自噬作用是結(jié)核感染中的一個(gè)重要表現(xiàn)，因此結(jié)核感染相關(guān)的外泌體中的miRNA-323a-3p的低表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)分子ULK2參與感染后的自噬通路。

圖6 miRNA-323a-3p靶基因預(yù)測(cè)Venn圖Fig 6 Venn diagram of miRNA-323a-3p target gene prediction

3 討論

Mtc是一種典型的胞內(nèi)感染菌且可以逃避溶酶體的降解而造成持續(xù)感染，Mtc主要通過(guò)進(jìn)入巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用。THP-1是一種常用的作為結(jié)核菌感染體外細(xì)胞的模型，可利用一系列毒力因子調(diào)節(jié)幾種宿主因子的表達(dá)，使細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)存活，并導(dǎo)致抗炎反應(yīng)，抑制下游促炎信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[18-19]。自噬是一種溶酶體依賴(lài)性降解過(guò)程，是巨噬細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染的關(guān)鍵天生宿主防御機(jī)制，尤其是Mtc[20-21]。因此，關(guān)于結(jié)核菌感染以及巨噬細(xì)胞自噬作用成為了研究結(jié)核發(fā)病機(jī)制的重要方向。

越來(lái)越多的證據(jù)表明外泌體包含了多種具有代表性的生物分子，可在細(xì)胞間通訊發(fā)揮重要作用，其臨床應(yīng)用亦得到了極大的發(fā)展[6,22-23]?；诓煌遗蒹w密度差異、表面電荷差異以及大小和分子量的不同，外泌體的提取有多種方法，包括超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、共沉淀法以及凝膠排阻層析法等，但每種方法都有其優(yōu)勢(shì)和不足[5]。目前，超速離心法和蔗糖密度梯度離心法能獲得較高純度的外泌體，已成為外泌體提取的金標(biāo)準(zhǔn)，但上述2種方法均存在產(chǎn)量較低的問(wèn)題[5]。

現(xiàn)階段，關(guān)于外泌體與疾病的研究多集中在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展方面。Allenson等[24]研究發(fā)現(xiàn)，早期胰腺癌外泌體來(lái)源的DNA中的鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）的高突變率與高發(fā)病率相關(guān)。關(guān)于外泌體在肺癌、前列腺癌等癌癥中的作用也均有研究[25-26]。一些關(guān)于外泌體與結(jié)核病的研究表明，外泌體在結(jié)核菌感染的過(guò)程中扮演著重要作用。Smith等[27]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)表明，外泌體在結(jié)核菌感染期間能夠促進(jìn)T細(xì)胞的免疫作用，且是細(xì)胞外抗原的重要來(lái)源。Diaz等[28]研究表明，結(jié)核菌的感染會(huì)使巨噬細(xì)胞釋放的外泌體的膜蛋白發(fā)生改變。Bhatnagar等[29]利用結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞并獲取其釋放的外泌體進(jìn)行體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于結(jié)核菌感染的巨噬細(xì)胞的外泌體在體內(nèi)及體外都可以引起炎癥反應(yīng)。因此越來(lái)越多的研究表明，外泌體在結(jié)核感染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，為結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展及機(jī)制研究提供了新的方向。

之前有關(guān)miRNA與結(jié)核的研究已有部分報(bào)道[30]，且當(dāng)前的相關(guān)研究多集中在血漿、血清、全血、巨噬細(xì)胞或外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）中，其中大部分的研究主要關(guān)注游離的miRNA，如 Let-7家 族、miR-146b、miR-29家 族、miR-27a以 及miR-155等都在結(jié)核相關(guān)的研究中被報(bào)道過(guò)[30-33]，而這些miRNA在我們的研究中也被發(fā)現(xiàn)。隨著對(duì)外泌體研究的不斷深入，一些研究開(kāi)始關(guān)注外泌體來(lái)源的miRNA與結(jié)核之間的聯(lián)系。外泌體中發(fā)現(xiàn)了不同的RNA分子，包括mRNA、核糖體RNA（rRNA）、miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）[34]；由于受到外泌體膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)，降低了RNA酶對(duì)RNA的降解作用，使其中的RNA尤其是miRNA的存在更加穩(wěn)定，為miRNA作為結(jié)核潛在標(biāo)志物的研究提供了良好條件[35]。Singh等[36]通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染后的巨噬細(xì)胞分泌的外泌體的表征及小鼠的mRNA和miRNA的表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，與未感染的巨噬細(xì)胞相比，感染后的巨噬細(xì)胞分泌的外泌體中miRNA豐度較低，且出現(xiàn)了100多種轉(zhuǎn)錄物在感染組中富集或僅存在于感染組中，其中包括與免疫應(yīng)答密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物。Zhang等[37]通過(guò)結(jié)核分枝桿菌感染RAW 264.7巨噬細(xì)胞并提取外泌體來(lái)源的總RNA發(fā)現(xiàn)，miR-20b-5p水平的上調(diào)抑制了RAW 264.7巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的存活，而miR-20b-5p水平的下調(diào)增強(qiáng)了結(jié)核分枝桿菌在RAW 264.7巨噬細(xì)胞中的存活。

另外有一些研究表明，在不同疾病類(lèi)型下或同一疾病的不同階段下，外泌體來(lái)源的miRNA也存在顯著差異，其將有利于對(duì)疾病的診斷與鑒別診斷。Wang等[38]對(duì)來(lái)自肺腺癌、結(jié)核病和其他良性病變的3組患者的胸腔積液中外泌體進(jìn)行檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p、miR-451a和miR-150-5p在結(jié)核病胸腔積液來(lái)源的外泌體中與其他良性病變的外泌體中存在差異表達(dá)。Mortaz等[39]通過(guò)從人體血液中分離單個(gè)核細(xì)胞，再將其誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞，利用BCG感染巨噬細(xì)胞，收集細(xì)胞分泌的外泌體中的RNA與未感染組比較，BCG感染后巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體中以Let-7家族成員、miR-155、miR-146a、miR-145和 miR-21為主，并且與一些免疫相關(guān)途徑有關(guān)。值得注意的是，Let-7家 族、miR-155、miR-146a、miR-150-5p和 miR-21也出現(xiàn)在我們的差異表達(dá)的miRNA中。

miRNA-29家族在結(jié)核的研究中多次被報(bào)道。hsamiR-29a-3p在活動(dòng)性結(jié)核患者中顯著上調(diào)[40]。Kleinsteuber等[16]的工作顯示，來(lái)自結(jié)核病兒童患者的CD4+T細(xì)胞中miR-29a和miR-142-3p表達(dá)較低，且與健康的潛伏結(jié)核感染兒童相比，全血miRNA候選分析證實(shí)結(jié)核病兒童中miR-26a、miR-29a和miR-142-3p的表達(dá)均較低。Pan等[17]通過(guò)招募112名患有結(jié)核性腦膜炎的兒童和130名健康兒童，采用qPCR檢測(cè)miR-29a在PBMC和腦脊液中的表達(dá)；結(jié)果顯示結(jié)核性腦膜炎組miR-29a的表達(dá)顯著上調(diào)。Ma等[41]通過(guò)BCG感染小鼠后發(fā)現(xiàn)miR-29的下調(diào)，從而改變IFN-γ的產(chǎn)生，最終影響免疫應(yīng)答。Yi等[42]利用細(xì)胞缺陷型的結(jié)核分枝桿菌感染RAW264.7細(xì)胞后與野生型結(jié)核分枝桿菌組相比較發(fā)現(xiàn)miR-29b的表達(dá)有明顯的下調(diào)，從而導(dǎo)致IFN-γmRNA的表達(dá)顯著升高。對(duì)比我們的研究結(jié)果，miRNA-29a-3p和miRNA-29b-3p在臨床樣本的驗(yàn)證中均未顯示出顯著差異，miRNA-29b-3p出現(xiàn)了與Kleinsteuber等[16]一致性改變的趨勢(shì)，可能和我們的有限樣本量存在較大關(guān)系；同時(shí)我們研究的是外泌體中miRNA，與游離的miRNA表達(dá)可能存在差異；另外，通過(guò)超速離心方法獲取外泌體并提取總RNA與試劑盒直接提取血漿、血清或細(xì)胞來(lái)源的總RNA間也存在很大的差異。

將細(xì)胞培養(yǎng)上清液外泌體測(cè)序結(jié)果與臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果相結(jié)合發(fā)現(xiàn)，miRNA-323a-3p在BCG組或結(jié)核病組出現(xiàn)了一致性改變即表達(dá)均顯著下調(diào)；然而在目前，關(guān)于miRNA-323a-3p在結(jié)核病的研究尚未被報(bào)道。有關(guān)miRNA-323a的研究報(bào)道多集中于多囊卵巢綜合征、細(xì)胞增殖遷移、心血管疾病及異位妊娠等方面[43-46]。K?rner等[47]研究表明，miR-323a-3p通過(guò)參與T細(xì)胞產(chǎn)生IL-22的過(guò)程進(jìn)一步參與負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，而這一過(guò)程可能影響哮喘中的T細(xì)胞應(yīng)答。而關(guān)于IL-22與結(jié)核的研究也多有報(bào)道[48-49]，這些證據(jù)也為miRNA-323a在結(jié)核病中的研究提供了間接證據(jù)。

通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)ULK2為miRNA-323a-3p的潛在靶基因，而ULK是自噬信號(hào)通路唯一具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的核心蛋白。在自噬溶酶體組裝前，自噬信號(hào)是通過(guò)由ULK1或ULK2、骨架蛋白FIP200和自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG）產(chǎn)物mATG13組成的ULK復(fù)合物的活化介導(dǎo)的。而結(jié)核分枝桿菌感染與自噬過(guò)程密切相關(guān)，一些miRNA和細(xì)胞因子在其中發(fā)揮了重要作用[50-51]。

綜上所述，這些直接或間接證據(jù)為我們進(jìn)一步研究miRNA-323a-3p通過(guò)調(diào)控ULK2影響自噬并最終在結(jié)核分枝桿菌的感染中發(fā)揮作用提供了依據(jù)。本研究通過(guò)超速離心獲取外泌體在很大程度上去除了較大細(xì)胞內(nèi)囊泡體的感染，可以更加真實(shí)地反映外泌體內(nèi)miRNA富集的情況，然而仍然存在一些不足。后續(xù)我們將擴(kuò)大臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，為該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供更加有力的支撐；同時(shí)，為了更好地服務(wù)于臨床診斷，我們還將繼續(xù)關(guān)注miRNA-323a-3p在血漿游離miRNA中的表達(dá)情況。