宋玉卿，汪鴻, ，耿浩源，吳楠，于殿宇，王俊國*

1. 吉林工商學(xué)院（長春 130507）；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（哈爾濱 150030）

硒是一種稀有元素[1]，是大多數(shù)溫血類哺乳動物生理活動所必需的18種微量元素之一[2-3]，分為有機(jī)硒和無機(jī)硒[4-5]。硒具有抗氧化和抗癌作用[6-7]，還具有預(yù)防心腦血管疾病[8]、增強(qiáng)人體免疫力[9-10]等多種生物學(xué)功能。通過膳食攝取足夠的硒，可起到預(yù)防有關(guān)疾病的作用[11]。然而，硒在地殼里的含量少且分布不均勻[12-13]。在中國許多地區(qū)硒攝入含量水平偏低，處于缺硒和低硒的狀態(tài)[14]。研究表明，大骨節(jié)病、白內(nèi)障、糖尿病等疾病與缺硒有關(guān)，所以高效低毒的補(bǔ)硒劑成為研究熱點(diǎn)[15]。需要注意的是，硒的需要量與中毒量之間范圍較小[16]，在食物補(bǔ)硒或藥物補(bǔ)硒時(shí)要嚴(yán)格控制硒的量[17]。

現(xiàn)今，主要的補(bǔ)硒劑形式分為2種，一種是有機(jī)形式的硒代蛋氨酸，另一種是無機(jī)形式的亞硒酸鈉，但這種補(bǔ)硒劑的轉(zhuǎn)化率低且毒性偏高。而采用微生物代謝方式吸收無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，既便宜又安全?，F(xiàn)有研究表明酸乳發(fā)酵劑具有優(yōu)良的富硒能力[18]，富硒培養(yǎng)后用來發(fā)酵牛乳，可顯著提高酸奶中硒含量，因此富硒酸奶可有效增加人體對有機(jī)硒的攝入量，同時(shí)可有效減少奶中的應(yīng)激因子對于發(fā)酵菌種的不利影響。

試驗(yàn)采用Lyofast LH 13瑞士乳桿菌、Lyofast LB 8保加利亞乳桿菌復(fù)合菌種進(jìn)行富硒，通過單因素試驗(yàn)研并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳菌體富硒條件；利用最優(yōu)富硒菌體發(fā)酵復(fù)原全脂牛乳并對所得富硒酸乳進(jìn)行理化指標(biāo)測定，為富硒食品的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lyofast LH 13瑞士乳桿菌、Lyofast LB 8保加利亞乳桿菌：北京多愛特生物科技有限公司；MRS固體培養(yǎng)基粉：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；亞硒酸鈉：北京萬佳首生物科技有限公司；3, 3-氨基聯(lián)苯胺：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高溫蒸汽殺菌鍋，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；754型紫外分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；NDJ-5S流變儀，蘇州賽恩斯儀器有限公司。

1.2.1 MRS液體培養(yǎng)基制備

取固體培養(yǎng)基粉末54.0 g，加入蒸餾水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝到100 mL的MRS液體培養(yǎng)基，在121 ℃下高壓滅菌15 min，待用。

1.2.2 菌體富硒方法

將Lyofast LH 13瑞士乳桿菌和Lyofast LB 8保加利亞乳桿菌復(fù)合菌體接入至MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，搖勻，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；配制一定濃度的亞硒酸鈉溶液，滅菌，在無菌條件下，將亞硒酸鈉溶液加入到1.3.1中分裝好的100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，搖勻后接入活化的復(fù)合菌體，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行富硒培養(yǎng)。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化菌體富硒條件

對復(fù)合菌體進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在瑞士乳桿菌和保加利亞乳桿菌為1∶1混合菌種條件下，考察硒質(zhì)量濃度（3，6，9，12和15 μg/mL），加入硒時(shí)間（0，5，15，25和35 h），富硒培養(yǎng)時(shí)間（40，50，60，70和80 h），接種量（菌懸液體積分?jǐn)?shù)2%，3%，4%，5%和6%）對菌體含硒量影響。依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.4 液態(tài)發(fā)酵劑制備

收集復(fù)合菌體富硒培養(yǎng)產(chǎn)物，將其置于50 mL無菌離心管內(nèi)，在10 000 r/min，4 ℃下離心10 min。棄去上清液，用生理鹽水洗滌菌體3次，后取一定量的預(yù)先經(jīng)過121 ℃滅菌的復(fù)原乳沖洗復(fù)合菌體至菌體表面無機(jī)硒無殘留并稀釋至約4.0×108CFU/mL濃度，制得液態(tài)富硒發(fā)酵劑。

1.2.5 富硒菌體發(fā)酵方法

參考文獻(xiàn)[5]發(fā)酵方法并加以改進(jìn)，試驗(yàn)采用富硒發(fā)酵劑接種量5%，在發(fā)酵溫度43 ℃條件下，對復(fù)原牛乳進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間6 h，冷卻至4 ℃后熟12 h。

1.2.6 硒含量測定

硒含量測定：3, 3-氨基聯(lián)苯胺法[19]。

1.2.7 發(fā)酵酸乳貯藏穩(wěn)定性測定

將發(fā)酵后熟的富硒酸乳在4 ℃下貯藏21 d，分別對0，3，6，9，12，15，18和21 d時(shí)富硒酸乳的酸度、pH、黏度和持水率進(jìn)行測定。

1.2.7.1 發(fā)酵酸乳酸度測定

測定時(shí)取10 mL樣品于錐形瓶中，加入20 mL蒸餾水稀釋，滴入幾滴0.5%酚酞作指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，按所消耗的NaOH的毫升數(shù)表示酸度。

1.2.7.2 發(fā)酵乳黏度測定

采用流變儀進(jìn)行測定。取適量的樣品酸奶于燒杯中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速50 r/min，將轉(zhuǎn)子放入待測樣品酸奶中測定其黏度，記錄下前3次數(shù)據(jù)，取平均值。

1.2.7.3 發(fā)酵pH測定

20 ℃下，用pH計(jì)直接測定樣品酸奶的pH，等待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)即可。

1.2.7.4 發(fā)酵酸乳持水率測定

取25 g酸乳樣品，置于高速離心機(jī)內(nèi)，在25 ℃，5 000 r/min條件下離心25 min[28-29]。棄上清液，測量離心后乳清質(zhì)量。

式中：m1為離心后析出乳清質(zhì)量，g；m2為酸乳質(zhì)量，g。

1.2.7.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 8.6與Design Expert 8.0.6進(jìn)行分析和繪制。用SPSS 17.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，并采用Tukey檢驗(yàn)（p＜0.05）檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制得硒標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖1，得線性回歸方程y=0.024 9x+0.005 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4。

圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同富硒條件對菌體含硒量的影響

2.2.1 不同硒濃度對菌體含硒量的影響

無菌條件下，在MRS液體培養(yǎng)基中接入5% 1∶1的復(fù)合菌體，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在菌體培養(yǎng)25 h后分別加入亞硒酸鈉，使MRS液體培養(yǎng)基質(zhì)量濃度為3，6，9，12和15 μg/mL，搖勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h，后測定菌體含硒量。

不同硒濃度對菌體含硒量的影響如圖2所示。硒質(zhì)量濃度在3～9 μ g/mL范圍內(nèi)，Lyofast LH 13瑞士乳桿菌和Lyofast LB 8保加利亞乳桿菌混合菌體含硒量先上升，在硒質(zhì)量濃度9 μg/mL時(shí)菌體含硒量最高。隨后菌體含硒量變化不顯著，這是因?yàn)閬單徕c有一定毒性，過量的亞硒酸鈉對復(fù)合解菌體生長和菌體正常代謝有抑制性[20-21]，使復(fù)合菌體對硒的轉(zhuǎn)化能力有所下降。所以加硒質(zhì)量濃度為9 μ g/mL時(shí)，復(fù)合菌種富硒效果最佳。

圖2 不同硒質(zhì)量濃度對菌體含硒量的影響

2.2.2 不同加硒時(shí)間對菌體含硒量的影響

在MRS液體培養(yǎng)基中接入5% 1∶1的混合菌種，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在復(fù)合菌體培養(yǎng)0，5，15，25和35 h后加入亞硒酸鈉溶液并保持MRS液體培養(yǎng)基中硒含量9 μg/mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中富硒培養(yǎng)60 h，測定菌體含硒量。

加硒時(shí)間對菌體含硒量的影響如圖3所示。Lyofast LH 13瑞士乳桿菌和Lyofast LB 8保加利亞乳桿菌復(fù)合菌體隨著加入硒溶液時(shí)間的延長，菌體含硒量上升，在復(fù)合菌體培養(yǎng)后25 h時(shí)加硒，菌體含硒量達(dá)最高。此時(shí)菌種處在對數(shù)生長期，繁殖代謝能力旺盛。且微生物轉(zhuǎn)運(yùn)，還原硒以及對硒的其他代謝需要專一性的酶，同時(shí)受到環(huán)境pH影響。在培養(yǎng)25 h后，pH下降，菌體體內(nèi)硒的運(yùn)載載體對硒的運(yùn)載效率下降，富硒效果下降。所以在25 h時(shí)加入硒最佳。

圖3 不同加硒時(shí)間對菌體含硒量的影響

2.2.3 不同富硒培養(yǎng)時(shí)間對菌體含硒量的影響

在MRS液體培養(yǎng)基中接入5% 1∶1的混合菌種，在菌體培養(yǎng)25 h后加入亞硒酸鈉溶液，保持MRS液體培養(yǎng)基中硒含量9 μg/mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別富硒培養(yǎng)40，50，60，70和80 h，測定菌體含硒量。

富硒培養(yǎng)時(shí)間對菌體含硒量的影響如圖4所示。在40～60 h，復(fù)合菌體含硒量呈上升趨勢。在60 h時(shí)，菌體含硒量最高，隨后菌體含硒量下降。這是因?yàn)槲⑸镌谧钸m條件下，可以保持最佳生長狀態(tài)，隨后因培養(yǎng)基中硒含量不足，菌體轉(zhuǎn)化硒受限。培養(yǎng)時(shí)間過長，菌體發(fā)生老化，其增殖能力和富硒能力有所下降，在60 h后菌體含硒量呈下降趨勢。因此，適宜的富硒培養(yǎng)時(shí)間為60 h。

圖4 不同富硒培養(yǎng)時(shí)間對菌體含硒量的影響

2.2.4 不同接種量對菌體含硒量影響

分別以2%，3%，4%，5%和6%不同接種量在MRS液體培養(yǎng)基中接入1∶1的混合菌種，在復(fù)合菌體培養(yǎng)25 h后加入亞硒酸鈉溶液，并保持MRS液體培養(yǎng)基中含硒量9 μg/mL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中富硒培養(yǎng)60 h，測量菌體含硒量。

接種量對菌體含硒量的影響如圖5所示。接種量的大小影響到菌體的生長和富硒能力。接種量過大，會引起菌體生長過于旺盛，菌體內(nèi)競爭，相互抑制，復(fù)合菌體生長不充分，其代謝和富硒力下降。接種量過小，菌體濃度小，菌體生長、代謝緩慢，影響富硒效果。當(dāng)接種量從2%～5%時(shí)，菌體含硒量隨接種量增加而呈上升趨勢隨后變化不顯著。所以接種量在5%時(shí)最佳，菌體含硒量最高。

圖5 不同接種量對菌體含硒量的影響

2.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對菌體發(fā)酵過程進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，研究采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)，在復(fù)合菌體培養(yǎng)25 h后加入硒溶液，選取硒濃度（A）、接種量（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）為自變量，以菌體含硒量（R）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平編碼見表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，（p＜0.05為顯著項(xiàng)）。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到菌體含硒量（R）對硒質(zhì)量濃度（A）、接種量（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）的回歸方程為：R=+543.60+7.88A+11.25B+8.38C+6.50AB+14.25AC-15.50BC-40.43A2-31.18B2-24.92C2。

表1 因素水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

圖6分別給出硒濃度、接種量和培養(yǎng)時(shí)間交互作用對菌體含硒量的響應(yīng)曲面圖。

圖6 菌體含硒量值響應(yīng)面圖

由圖6可以看出，3個(gè)變量：硒質(zhì)量濃度（C）、接種量（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）。在兩兩交互時(shí)，保持其中1個(gè)變量不變，隨著另外2個(gè)變量的增加，菌體含硒量呈上升趨勢，當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)又呈下降趨勢。其中，培養(yǎng)時(shí)間和硒濃度對菌體含硒量影響較大，硒濃度和接種量對菌體含硒量的影響較大，其中培養(yǎng)時(shí)間和接種量對菌體含硒量影響最大。

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表3。

為檢驗(yàn)在響應(yīng)面優(yōu)化出的條件下所得結(jié)果的可靠性，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的菌體含硒量554 μg/g，響應(yīng)面優(yōu)化的預(yù)測值與試驗(yàn)值之間的擬合性良好。

表3 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

2.3 酸度和pH測定

pH和酸度的變化如圖7所示。富硒酸乳的酸度隨著貯藏天數(shù)的增加有所增加，在第21天時(shí)達(dá)到97.4°T，在貯藏期內(nèi)變化明顯。其pH有所下降隨后變化緩慢趨于穩(wěn)定。由于隨著時(shí)間的變化，酸乳pH下降，富硒酸乳處在酸性環(huán)境，乳酸菌的增殖活力下降，乳酸菌產(chǎn)生乳酸速度變慢，使pH和酸度趨于穩(wěn)定。

圖7 酸度和pH隨貯藏天數(shù)的變化曲線

2.4 持水率和黏度測定

圖8 持水率和黏度隨貯藏天數(shù)的變化曲線

持水率和黏度是酸乳的重要品質(zhì)指標(biāo)，影響酸奶的穩(wěn)定性。從圖8中可以看出，黏度隨貯藏天數(shù)的增加有所上升，第9天時(shí)達(dá)到最大值，因?yàn)橘A藏期內(nèi)隨著酸乳pH的降低，有利于酸奶凝膠的形成。在第9天后酸乳的黏度下降，由于在酸乳中，殘留的霉菌繁殖旺盛，分解酸乳中的凝膠物質(zhì)，使得黏度下降。持水率隨著貯藏天數(shù)的增加而有所下降。在前7 d內(nèi)變化明顯，隨后趨于穩(wěn)定。這是由于在貯藏期內(nèi)，隨著pH的下降，酸乳的酸度變化較大，乳清析出明顯，酸乳穩(wěn)定性下降，蛋白凝膠性變差，對酸乳的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有不良影響，使得其中的水分析出，持水率下降，后期酸乳中的活性菌生長緩慢，產(chǎn)酸減少，對酸乳的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響減弱，故持水率下降緩慢。

2.5 富硒酸乳中有機(jī)硒含量測定

酸乳中有機(jī)硒含量變化如圖9所示，在貯藏期內(nèi)，酸乳中有機(jī)硒含量變化不明顯，趨于穩(wěn)定。按1.2.6小節(jié)的方法測量硒含量，酸乳在貯藏期內(nèi)有機(jī)硒含量可達(dá)27.7 μg/kg。這是因?yàn)橛袡C(jī)硒在酸乳中存在形式穩(wěn)定，酸乳的酸度、pH和黏度等變化對有機(jī)硒穩(wěn)定性影響不大。所以有機(jī)硒可以穩(wěn)定的存在酸乳中，可為人體提供良好的硒來源。

圖9 酸乳中有機(jī)硒含量隨貯藏天數(shù)變化曲線

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到菌體富硒最優(yōu)條件：Lyofast LH 13瑞士乳桿菌和Lyofast LB 8保加利亞乳桿菌接種復(fù)合比例1∶1，加硒質(zhì)量濃度10 μ g/mL，接種量5%，培養(yǎng)25 h后加入硒溶液，培養(yǎng)時(shí)間60 h。利用此最優(yōu)條件下得到復(fù)合菌體含硒量554 μ g/g，硒轉(zhuǎn)化率為55.4%，菌體含硒量較高。經(jīng)過在貯藏期內(nèi)富硒酸乳理化指標(biāo)的檢測，結(jié)果表明，酸度、pH、黏度和持水率等指標(biāo)良好且酸乳中硒含量穩(wěn)定。因此，此富硒酸乳能為人體硒的攝入提供良好的來源。