金錦花，李科巖，張 玲，王玉慧，鄧曉明

（中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院整形外科醫(yī)院麻醉科，北京 100144）

酪氨酸激酶受體由20 個家族，近60 種膜蛋白組成。人類成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）是酪氨酸激酶受體家族中的一員，由四個高度保守的跨膜受體（FGFR1-4）和一個無細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（FGFR5）受體組成，主要集中在細胞表面[1-3]。

FGFR1 在幼年期或傷口愈合期擴張皮膚中的成纖維細胞和角質(zhì)細胞中表達[4-5]，F(xiàn)GFR1 的不適當表達、點突變、錯誤的選擇性剪切以及基因組改變都可導致FGF/FGFR1 信號傳導的調(diào)控紊亂[6-8]。為深入研究FGFR1 在皮膚創(chuàng)傷修復發(fā)生過程中的作用機制，筆者構(gòu)建了FGFR1 真核表達載體pcDNA3.1-FGFR1，為后繼研究FGFR1 的醫(yī)學應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑真核表達載體p-CDNA3.1（-），E Coli.DH5a 菌株，HEK293T 細胞為本實驗室保存。LipofectamineTM 3000 購于美國Invotrigen 公司。逆轉(zhuǎn)錄酶，Pyrobest 高保真DNA 聚合酶，限制性核酸內(nèi)切酶BamH I and Hind III，T4 連接酶均購于日本Takara 公司。鼠抗人HA 單克隆抗體，HRP-山羊抗鼠二抗購自Cell Signaling Technology 公司。Goat anti-mouse Cy3 二抗購自Thermo 公司。其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 引物設計及合成參照GenBank 的FGFR1基因序列（NM_023110.2），采用Primer 5.0 軟件設計引物:（1）克隆FGFR1 基因的引物：上游引物序列為5'-ATATGGATCCGCCGCCACCATGTGGAGCTGGAAGTGC-3'，下游引物序列為5'-AAGCTTTCACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGCGGCGTTTGAGTCCGCCA-3'，為了便于和載體pCDNA3.1 連接，在此對引物的兩端分別加入了BamH I and Hind III 酶切位點。為了便于后續(xù)對表達蛋白的檢測，在下游引物中加入了HA 標簽的序列；（2）pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒的鑒定引物：上游引物序列為5'-ATGTGGAGCTGGAAGTGC-3'，下游引物序列為5'-TCAGCGGCGTTTGAGTCCGC-3'，所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 FGFR1 基因的克隆采用RNA 抽提試劑盒（Qiagen 公司）提取人胎盤組織中的總RNA，并以總RNA 為模板，用Takara 公司的逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。PCR 擴增FGFR1 基因，擴增片段長度為2 469 bp。

1.2.2 pcDNA3.1-FGFR1 表達載體的構(gòu)建及載體鑒定限制性核酸內(nèi)切酶BamH I and Hind III 對PCR 產(chǎn)物及質(zhì)粒pcDNA3.1 進行雙酶切后，在T4 DNA 連接酶作用下16 ℃連接過夜。氯化鈣轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含氨芐青霉素（Amp）的平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取陽性克隆，進行BamH I 和Hind III 雙酶切鑒定和PCR 鑒定，陽性質(zhì)粒的菌液送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及細胞基因轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d 將HEK293T 細胞按3×105/mL 分別接種于6 孔板內(nèi)。待細胞貼壁后將2.5 μg質(zhì)粒 DNA，5 μL lipofectamineTM3000，用500 μL opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋并混勻，室溫靜置15 min；將DNA／lipofectamine 3000 混合物加入6 孔板，培養(yǎng)箱中孵育5 h 后換液。

1.2.4 免疫印跡檢測FGFR1 基因在HEK293T 細胞中的表達pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細胞48 h，裂解細胞，12%的SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)移法，電轉(zhuǎn)印到0.22 μm 孔徑的PVDF 膜上，在5%BSA 室溫封閉2 h。加入鼠抗人HA 一抗（1:3 000），兔抗人β-actin 一抗（1:3 000），4℃孵育過夜。一抗充分漂洗后，二抗室溫孵育1 h，加入HRP 顯色底物，X 光片曝光顯影。

1.2.5 免疫熒光檢測FGFR1 基因在HEK293T 細胞中的表達細胞接種在蓋玻片上培養(yǎng)，待細胞達到70%匯合度時，pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48 h，4%多聚甲醛室溫固定15 min，滴加鼠抗人HA 抗體液，4℃孵育過夜。一抗漂洗后再分別用CY3 一抗鼠IgG 孵育45 min，PBS 洗后，DAPI 復染核，抗淬滅封片劑封片。

2 結(jié)果

2.1 提取完整的人胎盤組織總RNA

從圖1 中可以清晰地看到28 S，18 SrRNA 兩條主帶清晰，表明所提的總RNA 完整性較好，無明顯降解，可用于后續(xù)RT-PCR 反應。

圖1 人胎盤組織總RNA 電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from human placenta tissue

2.2 克隆FGFR1 基因

PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，得到了一條特異性條帶（圖2），與預期擴增的片段大?。? 469 bp）一致，而且無非特異性條帶的干擾，擴增的特異性較強。

圖2 FGFR1 基因的克隆Fig.2 Cloning of FGFR1 gene

2.3 正確構(gòu)建pcDNA3.1-FGFR1 真核表達質(zhì)粒

電泳結(jié)果（圖3）顯示，兩條片段大小分別為5.5 Kbp 和2 469 bp，表明目的片段已成功的克隆在pcDNA3.1 載體上。將陽性重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果證明本文擴增的FGFR1 cDNA 序列與基因庫的序列完全一致。

圖3 雙酶切法鑒定pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒Fig.3 Identification of the pcDNA3.1-FGFR1 by restrictive enzyme digestion assay with BamH I and HindIII

2.4 免疫印跡分析FGFR1 基因在HEK293T 細胞中的高效表達

結(jié)果見圖4，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FGFR1 的HEK 293T 細胞裂解產(chǎn)物有一條明顯的特異性條帶，大小約130 KD，而對照組（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1 載體的HEK293T 細胞）結(jié)果為陰性。表明轉(zhuǎn)染pCDNA3.1載體的HEK293T 細胞中高水平地表達了外源性的FGFR1 因子。實驗重復3 次以上，結(jié)果均一致。

圖4 免疫印跡分析FGFR1 在HEK293T 細胞的表達Fig.4 Immunoblot analysis of FGFR1expression in HEK293T cells

2.5 免疫熒光分析FGFR1 基因在HEK293T 細胞中的高效表達

免疫熒光染色分析（圖5）表明，在對照組細胞（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1 載體的HEK293T 細胞）的細胞膜中沒有FGFR1 的表達（圖5A）。而在細胞膜中有較強的紅色熒光信號（圖5B）

3 討論

成纖維細胞生長因子（FGFs）是一組同源的肝素結(jié)合多肽，其家族包含23 個成員[9]，它們具有很高的序列同源性及類似的生物學功能[10]。FGFs具有廣泛的生物學功能，可以調(diào)控胚胎發(fā)育中細胞的增殖、遷移、分化；參與機體內(nèi)血管生成、組織修復；維護正常機體組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能。成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFR）是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體，其家族成員都是酪氨酸激酶受體[11]，F(xiàn)GFR 失調(diào)與多種癌癥有關(guān)，如尿路上皮癌、肝細胞癌、卵巢癌和肺腺癌[12-15]，由于其重要的功能，F(xiàn)GFR 被認為是治療各種癌癥的藥物靶標[16-17]。在多種成纖維細胞生長因子受體中，F(xiàn)GFR1 在傷口愈合、生長發(fā)育、骨骼形成、細胞的增殖、分化、血管生成等進程中起著十分重要的作用[18-22]，以FGFR1 為研究方向的皮膚創(chuàng)傷愈合治療，展現(xiàn)了可期的應用前景[23]，如果筆者能夠獲得FGFR1真核表達載體，就有可能將其應用于后續(xù)皮膚創(chuàng)傷的治療研究。

圖5 免疫熒光分析FGFR1 在293T 細胞的表達Fig.5 Immunofluorescence analysis of FGFR1 expression in 293T cells

本實驗成功構(gòu)建了小鼠FGFR1 重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-FGFR1，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)讓其在HEK293T 細胞表達，為進一步研究FGFR1在胚胎發(fā)育期及創(chuàng)傷修復過程中的皮膚修復奠定實驗基礎。本研究的創(chuàng)新點在于通過免疫熒光手段分析FGFR1 在293T 細胞表達以后在細胞的定位情況，通過基因工程手段給FGFR1 加上HA 標簽，方便后期的western blot 檢測和免疫熒光檢測，以及將來研究免疫共沉淀技術(shù)檢測FGFR1 和其他分子的相互作用。