朱文勇，王明清，宋紹輝，李雙麗，胡文著，廖國陽

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南昆明 650118）

b 型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae type b，Hib），是引起小兒細(xì)菌性腦膜炎和急性呼吸道傳染病的主要致病菌，也可導(dǎo)致敗血癥、會厭炎、脊髓炎等多種侵襲性疾病[1-2]。目前，Hib 結(jié)合疫苗是國際公認(rèn)的最為有效的細(xì)菌性疫苗之一[3]。目前上市的Hib 結(jié)合疫苗，都是由Hib 莢膜多糖經(jīng)活化，通過己二酰肼（adipyl dihydrazide，ADH）與破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）蛋白共價結(jié)合制備而成。其中莢膜多糖的提取均采用傳統(tǒng)工藝[4]，過程中使用大量的苯酚，而多糖活化也采用極毒的溴化氰，嚴(yán)重影響操作者的身體健康，破壞生態(tài)環(huán)境。為此，國內(nèi)外開展了細(xì)菌莢膜多糖提取新工藝[5-8]及疫苗制備新方法的研究[9-12]，其中筆者所在團隊建立了利用Triton X-114 提取Hib 莢膜多糖的新工藝[13]及基于1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼（1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，CDAP）活化的疫苗制備新方法[14]也做了相應(yīng)研究，初步結(jié)果證明，新工藝所制備Hib 結(jié)合疫苗質(zhì)量和效果完全達(dá)到目前新版藥典要求，但如真正投入生產(chǎn)還需對其穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。本研究通過對制備疫苗的長期穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)控，為新工藝投入生產(chǎn)提供試驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

多糖及載體蛋白多糖3 批（批號：20120301、20120512、20130218）載體蛋白3 批（破傷風(fēng)類毒素，TT）（批號：20110506、20110712、20110920），均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備。實驗動物Bablb/c 小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）-2013-0004，豚鼠，兔均購自昆明楚商科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）K2012-0002。CDAP、ADH、碳二亞胺[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopmpylcarbodiimide，EDAC]均購自美國Sigma 公司。Hib 抗血清、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 抗體均購自美國BD 公司。TT 抗體購自中國食品與藥品檢定研究院。NaCl（藥用級）購自自貢鴻鶴公司。AKTA 純化儀及填料購自美國GE 公司。

1.2 結(jié)合疫苗原液的制備

Hib 菌株發(fā)酵后經(jīng)Triton X-114 方法提取莢膜多糖[13]，莢膜多糖經(jīng)CDAP 活化后，與ADH 在堿性條件下衍生，制備出多糖-酰肼基衍生物，在EDAC 作用下與TT 偶聯(lián)，形成多糖-蛋白結(jié)合物，經(jīng)Sepharose 4FF 純化，收集KD≤0.2 的結(jié)合物，用0.22 μm 濾膜除菌過濾，即為Hib 結(jié)合疫苗原液，后經(jīng)稀釋為Hib 結(jié)合疫苗。本實驗所用3 批Hib 結(jié)合疫苗批號分別為：20130402、20130403、20130504。

1.3 Hib 結(jié)合疫苗原液檢定

鑒定項目與方法均參照2010 年《中國藥典》三部中《b 流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制造檢定規(guī)程》中規(guī)定進(jìn)行。本實驗設(shè)計2-8℃長期穩(wěn)定性試驗，具體檢定項目與檢定時間見表1。

2 結(jié)果

按照2010 年《中國藥典》三部中規(guī)定中的方法對制品進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗，Hib 結(jié)合疫苗2～8℃保存了36 個月，結(jié)果見表1，其指標(biāo)中鑒別試驗、pH 值、多糖含量、無菌、異常毒性、熱源、細(xì)菌內(nèi)毒素含量結(jié)果穩(wěn)定，每次檢測結(jié)果差異不大，分子量大小隨時間增長略有下降，高分子結(jié)合物含量及效力試驗結(jié)果變化顯著，保存30 個月時，仍能達(dá)到《b 流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制造檢定規(guī)程》80%～100%的要求，陽轉(zhuǎn)率也能維持在80%，符合藥典要求。保存36 個月時，201304003 批疫苗高分子結(jié)合物含量低于80%，效力試驗陽轉(zhuǎn)率也低于80%，不符合藥典要求。

3 討論

穩(wěn)定性試驗是疫苗質(zhì)量控制研究的主要觀察項目之一，目的在于考察疫苗的質(zhì)量穩(wěn)定性，為疫苗在合理有效期或使用期提供科學(xué)依據(jù)[15]。原則上一般包括3 種方式[12]：（1）強制條件試驗研究，用于了解產(chǎn)品在短期偏離儲存條件和極端情況下產(chǎn)品的變質(zhì)或降解情況；（2）加速穩(wěn)定性研究，用于確定產(chǎn)品在處理和使用過程中引起的降解，數(shù)據(jù)可作為制定有效期的輔助依據(jù)；（3）實際儲存條件下的實時穩(wěn)定性研究（長期穩(wěn)定性研究），研究可以作為設(shè)定產(chǎn)品保存條件和有效期的主要依據(jù)。

本研究主要檢測了新工藝制備的Hib 結(jié)合疫苗的長期穩(wěn)定性試驗，驗證了該工藝在儲存條件（2～8℃）下，保存30 個月仍符合2015 年《中國藥典》三部的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，初步說明該疫苗能夠滿足2 年有效期要求，與傳統(tǒng)工藝制備Hib 結(jié)合疫苗結(jié)果[3]類似，為新工藝投入生產(chǎn)提供了依據(jù)。但是，

如上述穩(wěn)定性試驗研究原則所述，為全面評估該疫苗應(yīng)對運輸、極端環(huán)境及生產(chǎn)處理中的各種情況，后續(xù)仍應(yīng)該對其進(jìn)行強制穩(wěn)定性試驗和加速穩(wěn)定性試驗研究。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在疫苗的儲存過程中，其鑒別試驗、pH 值、多糖含量及異常毒性等關(guān)乎安全性的指標(biāo)相對穩(wěn)定，而其高分子結(jié)合物含量與效力試驗變化較明顯，且兩者結(jié)果具有相關(guān)性，這提示我們在后續(xù)實驗及生產(chǎn)過程中應(yīng)重視高分子結(jié)合物含量的指標(biāo)，同時應(yīng)該進(jìn)行更多批次的疫苗穩(wěn)定性試驗，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)統(tǒng)計，制定出合理的企業(yè)內(nèi)部生產(chǎn)放行標(biāo)準(zhǔn)，以免上市疫苗達(dá)不到預(yù)期效果。

表1 Hib 結(jié)合疫苗原液2～8℃長期穩(wěn)定性實驗檢測結(jié)果（1）Tab.1 Long term stability results of Hib conjugate stock solution at 2～8 ℃（1）

表1 Hib 結(jié)合疫苗原液2～8℃長期穩(wěn)定性實驗檢測結(jié)果（2）Tab.1 Long term stability results of Hib conjugate stock solution at 2～8 ℃（2）

表1 Hib 結(jié)合疫苗原液2～8℃長期穩(wěn)定性實驗檢測結(jié)果（3）Tab.1 Long term stability results of Hib conjugate stock solution at 2～8 ℃（3）