王 樂 ，范志祥，陳志彬，彭紅瑜，張延潔，張 璐，萬瑞雪，龍 莉

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，云南昆明 650500；2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬院生殖遺傳科，云南昆明 650031）

組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）是一種有527 個(gè)氨基酸[1]、3 條糖鏈組成的分子量為67KDa 的絲氨酸類蛋白水解酶，也是血管內(nèi)纖維蛋白溶解系統(tǒng)的主要活化劑。其生理作用是促進(jìn)血管內(nèi)纖維蛋白溶解，從而防止血栓形成和生長(zhǎng)。t-PA 在炎癥、損傷的愈合、癌癥的預(yù)后和轉(zhuǎn)移以及對(duì)其他疾病的易感性中起重要作用[2]。另外，t-PA 在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的各種神經(jīng)元中高度富集，包括新皮質(zhì)，錐體神經(jīng)元和海馬，因此參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些生理和病理過程，如學(xué)習(xí)和記憶，焦慮，癲癇，中風(fēng)，阿爾茨海默病和脊髓損傷[3]。t-PA 由染色體8p11.21 上的t-PA（纖溶酶原激活物組織類型）進(jìn)行基因編碼，包含8 個(gè)外顯子。在t-PA 基因中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)是內(nèi)含子8 中311bp Alu 序列的插入/缺失多態(tài)[4]。目前研究表明，t-PA 多態(tài)與中國(guó)漢族人群顳葉癲癇（temporallobeepilepsy，TLE）[5]、荷蘭人群心肌梗塞[6]、土耳其人群牙周炎[7-8]、克羅地亞等人群多發(fā)性硬化癥[9]、韓國(guó)人群十二指腸潰瘍相關(guān)[10]。目前為止，尚無有關(guān)彝族人群t-PA 基因Alu重復(fù)序列I/D 多態(tài)分布的報(bào)道，本研究應(yīng)用PCR技術(shù)研究t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)在云南昆明晉寧縣彝族健康人群t-PA 基因Alu 重復(fù)序列t-PA 基因Alu 重復(fù)序列中的分布情況。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

云南省昆明市晉寧縣雙河鄉(xiāng)彝族村民共275例，其中男88 例，女187 例，平均年齡（49.0±15.7）歲。均為該地區(qū)彝族，且所有對(duì)象對(duì)調(diào)查和檢測(cè)項(xiàng)目均知情并同意。通過病史、體檢、實(shí)驗(yàn)室和心電圖等檢查排除冠心病、高血壓、心肌病、瓣膜性心臟病和先天性心臟病者。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取用采血管取靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，白細(xì)胞分離，低滲溶血，酚-氯仿有機(jī)抽提法提取基因組DNA，-80℃保存。

1.2.2 目的片段PCR 擴(kuò)增特異性擴(kuò)增包含t-PA基因Alu 重復(fù)序列I/ D 的DNA 片段，引物序列（上游引物5'-GCTGTTCTCCTGACATCTTTATTGC-3'）下游引物（5'-GTGGTGAAGGCACTTTATTATCTAAG-3'）。反應(yīng)體系為10 μL 包括TaqDNA 聚合酶0.25 μL（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司），模板DNA0.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 3.5 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1min 進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 基因型鑒別取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以2 000 bp Marker 作對(duì)照，在UVP 凝膠成像儀上觀察結(jié)果。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生1 211 bp 的插入片段和900 bp 的缺失片段。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)算各組等位基因及基因型頻率，用Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)確定研究樣本的群體代表性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)

在275 名彝族對(duì)照受試者中，t-PA 基因Alu重復(fù)序列I/D 多態(tài)性相關(guān)基因型頻率和等位基因頻率及其預(yù)期值分布符合Hardy-Weinberg 平衡（X2＝0.2800，P＝0.600），具有群體代表性。

2.2 基因型鑒定

經(jīng)PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有3 種基因型分別為:（1）t-PA-Alu-I I 基因型，是一條1 211 bp 片段；（2）t-PA-Alu-I D 基因型，是兩條片段分別為1 211 bp 和900 bp；（3）t-PA-Alu-D D 基因型，是一條900 bp 的片段，見圖1。

圖1 t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性的3 種基因型Fig.1 Three genotypes of t-PA Gene Alu-repeat I/D polymorphism

2.3 t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性在云南彝族人群中的分布

在云南省昆明市晉寧縣雙河鄉(xiāng)275 名彝族健康人群中，經(jīng)鑒定，基因型分別為DD、ID 和II，各有75、133 和67 例。根據(jù)遺傳平衡定律可計(jì)算出相應(yīng)基因型的頻率分別為27.3%、48.4%、24.3%，等位基因D 和I 的頻率分別為51.5%和48.5%。在88 名男性中，DD、ID 和II 基因型頻率分別為23.86%、54.56%、21.59%，等位基因D 和I 的頻率分別為51.14%、48.86%；而在187 名女性中，DD、ID 和II 基因型頻率分別為28.88%、45.46%、25.67%，等位基因D 和I 的頻率分別為51.6%、48.4%，見表1。男性和女性相比，t-PA 基因Alu重復(fù)序列I/D 多態(tài)性的基因型頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2＝1.98，P＝0.371），基因頻率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2＝0.01，P＝0.918）。

表1 在彝族人群中t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性的分布［n（%）］Tab.1 The distribution of t-PA Gene Alu-repeat I/D polymorphism in Yi nationality population ［n（%）］

2.4 彝族t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/ D 多態(tài)性分布與其他種族比較

云南彝族人群與報(bào)道的巴基斯坦、印度、美國(guó)、韓國(guó)[11]、日本[2]人群相比較，基因型頻率和等位基因頻率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與英國(guó)人群相比較，無論基因型頻率還是等位基因頻率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

從基因型看，云南彝族人群II 基因型頻率為24.36%，低于巴基斯坦人群30.88%、日本人群30%、美國(guó)人群29.27%、印度29.39%、韓國(guó)20%均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低于英國(guó)人群33.71%并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。云南彝族人群ID 基因型頻率為48.36%，低于日本人群50%、英國(guó)人群48.95%、美國(guó)人群49.59%、高于巴基斯坦人群45.16%印度人群48.20%、韓國(guó)人群47.03%均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。云南彝族人群DD 基因型頻率為27.27%，高于巴基斯坦人群23.96%、印度人群22.41%、日本人群20%、美國(guó)人群21.14%；低于韓國(guó)人群32.97%均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高于英國(guó)人群17.33%并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

從等位基因看，云南彝族I 等位基因頻率為48.55%，低于美國(guó)人群54.07%、巴基斯坦人群53.45%、印度人群53.49%、韓國(guó)人群43.51%、日本人群55%均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低于英國(guó)人群58.19%并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。云南彝族人群D 等位基因頻率為51.45%，高于美國(guó)人群45.93%、巴基斯坦人群46.54%、印度人群46.51%、韓國(guó)人群56.49%、日本人群45%均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高于英國(guó)人群41.81%并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。綜上所述，t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性分布在不同民族之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 不同人群t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率［n（%）］Tab.2 Comparisons of genotype frequency and gene frequency of t-PA Gene Alu-repeat I/D polymorphism between Yi nationality and other populations ［n（%）］

3 討論

在t-PA 基因中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)多態(tài)是內(nèi)含子8中311bp Alu 重復(fù)序列的插入/ 缺失多態(tài)性（rs4646972）。Alu 序列的擴(kuò)增多態(tài)性作為人種分型重要依據(jù)之一。隨著后基因組計(jì)劃的開展，發(fā)現(xiàn)Alu 重復(fù)序列的插入或缺失可能還存在某種功能性影響，例如可能改變mRNA 的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，或者影響Alu 序列下游內(nèi)含子的剪接[11-12]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性在心血管疾病[13]、癲癇[5]、多發(fā)性硬化癥[9]、十二指腸潰瘍[10]、腦栓塞[12]、牙周炎[7]等多種疾病中起著重要的作用。由于不同種族的遺傳背景、生活習(xí)性、環(huán)境因素各不相同從而導(dǎo)致了不同種族對(duì)某些疾病的易感性不同。據(jù)報(bào)道，Alu 重復(fù)多態(tài)性與荷蘭受試者急性心肌梗死的發(fā)生率增加有關(guān)[14]，但在北美[15]或英國(guó)[16]的研究中則無關(guān)。間接說明了Alu 重復(fù)多態(tài)性可能與種族差異有關(guān)。

現(xiàn)有報(bào)道表明彝族與其他民族和種族之間存在遺傳差異，例如云南彝族的ACE 基因G2350A、AT1R 基因A1166C、AGT 基因M235T、MCP-1 基因G-2518A、CX3CR1 基因T280M、CYP4A11 基因rs9333025 A/G 等位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率與一些種族或民族均有顯著差異[17-23]。本研究顯示云南彝族人群t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性與英國(guó)人群相比較，無論基因型分布還是基因頻率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這一結(jié)果與前面報(bào)道的研究結(jié)果一致。

綜上所述，t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)在心血管疾病、癲癇、多發(fā)性硬化癥、十二指腸潰瘍、腦栓塞、牙周炎等多種疾病中起著重要的作用，本研究旨在云南彝族t-PA 基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性與其他種族進(jìn)行比較，為探究t-PA基因Alu 重復(fù)序列I/D 多態(tài)性與其他疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。