田紅彪，王玉霄，王燕，鄭曉拓，張瑞紅，孫麗靜

（保定市第四中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 072350）

銅綠假單胞菌作為醫(yī)院主要的條件致病菌之一，由于抗菌藥物尤其是廣譜抗生素的不合理使用，導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生，使得臨床常用的抗菌藥物治療無效。銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制有多方面，生物膜的形成是其重要的耐藥機(jī)制之一，因?yàn)樯锬さ拇嬖冢~綠假單胞菌逃避了免疫監(jiān)視，使細(xì)菌避免暴露在抗菌藥物之下，原本敏感的抗菌藥物在臨床上治療效果差或無效。清除細(xì)菌生物膜，讓細(xì)菌重新暴露在敏感的抗菌藥物環(huán)境之下，抗菌藥物發(fā)揮應(yīng)有的殺菌作用，是我們應(yīng)該研究的一個(gè)方向。

1 材料與方法

1.1 材料 胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供），平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（杭州百思生物技術(shù)有限公司提供）。

1.2 收集臨床分離的10株銅綠假單胞菌菌株，分別制備成菌懸液約0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?/p>

1.3 制備胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基，9 mL/支分裝，高壓滅菌備用。

1.4 制備平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。

1.5 配制不同濃度的CaCl2溶液，濃度分別為5、15、45 mmol/mL。

1.2 方法

1.2.1 每個(gè)菌株取4支試管，分別編號(hào)0、1、2、3。

1.2.2 在0-4號(hào)試管中依次加入1 mL蒸餾水0、5、15、45 mmol/mL的CaCl2溶液。

1.2.3 吸取菌懸液10 μL分別接種于到上述試管中，放置搖床37 ℃培養(yǎng)。

1.2.4 分別在6、12和24 h經(jīng)超聲波振蕩，用PBS連續(xù)10倍稀釋接種于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基35 ℃ 48 h培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值（表1）。

1.2.5 接種銅綠假單胞菌的胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，觀察生物膜的絮狀物顆粒形成情況。

1.2.6 生物膜形成后滴加冰乙酸直至pH接近3.5，觀察生物膜的變化（圖1）。

2 結(jié)果

2.1 從表1中可以看出隨著鈣離子濃度的升高銅綠假單胞菌菌落數(shù)也隨之增加。

2.2 從圖1中可看到銅綠假單胞菌生物膜絮狀物顆粒隨鈣離子濃度的升高而增大。

2.3 加入EDTA的液體培養(yǎng)基銅綠假單胞菌菌落數(shù)和生物膜絮狀物顆粒減少。

2.4 加入冰乙酸后銅綠假單胞菌生物膜絮狀物顆粒并沒有立即完全消失。

3 討論

細(xì)菌生物膜是指正常細(xì)菌與細(xì)胞表面受體結(jié)合而黏附，并分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等胞外多糖聚合物，是細(xì)菌以非常精細(xì)的方式相互黏連所形成的膜樣結(jié)構(gòu)[1]。生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，包括細(xì)菌起始黏附、生物膜發(fā)展、生物膜擴(kuò)散和裂解等階段。在細(xì)菌黏附階段由于缺乏生物膜的保護(hù)，抗菌藥物易于發(fā)揮作用，幾乎所有的銅綠假單胞菌都可以形成生物膜，王忠等[2]的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過72 h左右后銅綠假單胞菌能夠形成穩(wěn)定的生物膜。臨床治療銅綠假單胞菌引起的感染應(yīng)當(dāng)在72 h內(nèi)采用有效的抗感染治療。細(xì)菌生物膜造成的慢性感染給臨床治療帶來了非常棘手的難題。

任何細(xì)菌均可形成生物膜，這是細(xì)菌的一種本能。具體某一種細(xì)菌能否形成生物膜，取決于生存環(huán)境，包括營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、滲透壓、pH、陰陽(yáng)離子濃度等。密度感應(yīng)系統(tǒng)作為一種信息交流調(diào)控機(jī)制，在細(xì)菌生物膜的形成和成熟中起著重要的作用。生物膜一旦形成，菌體之間彼此聚集促使微菌落形成，這便是菌體逃避機(jī)體免疫監(jiān)視及免被抗生素清除的主要原因[3]。目前認(rèn)為，高濃度的鈣離子可以穩(wěn)定和促進(jìn)細(xì)胞外多糖的釋放，增加生物膜結(jié)構(gòu)的聚集性和抑制生物膜的分解的功能[4]。在富含鈣離子培養(yǎng)基中的銅綠假單胞菌生物膜厚度是不含鈣離子培養(yǎng)基的10倍[5]，可見鈣離子是促進(jìn)生物膜的形成重要因子之一。Banin等[6]發(fā)現(xiàn)往培養(yǎng)基中加入EDTA，已形成的銅綠假單胞菌BF會(huì)發(fā)生降解破裂，促使銅綠假單胞菌從被膜中游離出來，并且EDTA對(duì)游離出被膜的細(xì)菌有殺滅作用。同時(shí)考察加入飽和量的Ba2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+四種離子對(duì)EDTA對(duì)被膜中的菌的游離效應(yīng)的阻斷作用，發(fā)現(xiàn)只有加入Fe2+后能完全阻斷EDTA的效應(yīng)，Mg2+、Ca2+只能部分阻斷。目前生物膜常用的物理清除方法主要有機(jī)械清除、超聲波、化學(xué)清除劑作用機(jī)理各不相同，主要包括天然產(chǎn)物、金屬離子如銅離子、表面活性劑和酶等。乙酸等弱有機(jī)酸及抗細(xì)菌生物膜能力的主要機(jī)制在于未解離狀態(tài)的算可以自由擴(kuò)散通過膜的疏水層，破壞膜內(nèi)微環(huán)境的陽(yáng)離子及陰離子平衡，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的乙酸開始解離、游離的氫離子逐漸積累，細(xì)胞內(nèi)蛋白降解、膜性結(jié)構(gòu)及DNA結(jié)構(gòu)損壞[7]，研究顯示乙酸確實(shí)有清除生物膜的作用。而生物清除主要是通過噬菌體殺死細(xì)菌細(xì)胞來瓦解生物膜的結(jié)構(gòu)，達(dá)到裂解和分散生物膜的目的。臨床治療有細(xì)菌生物膜引起的慢性感染，藥敏試驗(yàn)報(bào)告敏感的抗菌藥物往往治療效果差或無效，與銅綠假單胞菌生物膜有關(guān)，通過控制細(xì)菌生存的微環(huán)境，不能形成生物膜，使細(xì)菌處在浮游菌狀態(tài)，充分暴露在抗菌藥物環(huán)境下，避免發(fā)生免疫逃逸，才能使敏感的抗菌藥物發(fā)揮應(yīng)有的作用，感染病灶才可徹底治愈。

表1 不同濃度CaCl2和EDTA的TSB菌落計(jì)數(shù)平均值