任夢娟 ，史宏志*，楊明坤，周駿，劉百戰(zhàn)，楊惠娟，白若石，李洪亮，畢艷玖，李耕

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州 450002；2 上海煙草集團有限責(zé)任公司，上海 200082；3 河南省煙草公司許昌市公司襄城縣分公司，河南許昌 461700

煙堿是煙葉中主要的活性成分，不僅直接影響煙葉的生理強度，也是使人產(chǎn)生致癮性的主要成分[1-2]。Benowitz 等于1994 年首先提出把煙葉煙堿含量降至使人致癮的臨界值以下，可有效減少吸煙者對煙草的依賴性的理念[3]，并開展了大量相關(guān)研究[4-7]。世界衛(wèi)生組織（WHO）為了降低吸煙率，2015 年建議將卷煙煙絲中的煙堿含量降至0.4 mg/g 以下[8]，低于維持上癮所需的閾值[3]。美國食品和藥品管理局 （FDA）2018 年頒布了控制煙堿含量的監(jiān)管意見草案（ANPRM），提出可燃香煙具體潛在的煙堿水平為：0.3，0.4 和0.5 mg/g 的標準[9]，目前正考慮制訂強制性標準降低可燃香煙中的煙堿含量至不使人致癮的水平[10]。受ANPRM 影響，低/超低煙堿含量煙草的生產(chǎn)和論證成為國際煙草科技領(lǐng)域研究的新熱點。目前雖然可通過遺傳育種、遺傳工程、農(nóng)藝調(diào)控和化學(xué)萃取等途徑在一定程度上實現(xiàn)低/超低煙堿含量煙葉生產(chǎn)，但能否大規(guī)模投入使用尚存在不確定性[11]。煙堿是煙葉和煙氣中重要的具有生理活性的化學(xué)成分，大幅度降低煙堿含量對煙葉化學(xué)組成和感官質(zhì)量會產(chǎn)生顯著影響，且不同來源的低煙堿煙葉對感官質(zhì)量的影響不同[12-18]。由于煙堿和其他生物堿也是煙草特有亞硝胺 （Tobacco-specific nitrosamines, TSNAs）的直接前體物，煙葉中煙草生物堿和TSNAs 有直接的相關(guān)關(guān)系[19-21]。煙葉中煙堿含量的大幅度降低可能對TSNA 形成產(chǎn)生顯著的影響[22]。

嫁接栽培技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于瓜果、蔬菜種植上，能夠提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高植物抗性、促進養(yǎng)分吸收等[23-24]。嫁接可延緩煙草青枯病的發(fā)生，降低發(fā)病率和病情指數(shù)，提高煙株的產(chǎn)量、產(chǎn)值和均價[25]。以煙草為接穗嫁接到茄子上的嫁接苗青枯病的抗性明顯提高[26]，本課題組于2017 年通過煙茄嫁接生產(chǎn)出的極低煙堿的煙葉，蛋白質(zhì)、淀粉、總氮含量增加，總糖、還原糖含量降低[27]。但以煙茄嫁接生產(chǎn)的超低煙堿煙葉的感官質(zhì)量、消費者反應(yīng)及減害效果等影響尚不清楚。本研究以煙茄嫁接（烤煙為接穗，同科的茄子為砧木）獲得的超低煙堿含量煙葉為材料，探究了在通過嫁接技術(shù)選擇性降低煙堿含量對煙葉TSNAs、中性香氣物質(zhì)含量的影響，并以不同處理煙葉卷制單料煙進行煙氣參數(shù)測定和感官質(zhì)量評價，旨在明晰超低煙堿含量煙葉對煙葉和煙氣化學(xué)組成和感官質(zhì)量的影響，為超低煙堿含量煙葉生產(chǎn)可行性分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

本試驗于2017 年在河南省許昌市襄城縣王洛鎮(zhèn)王洛煙站，試驗材料：以青皮茄子（Solanum melongena L.）為砧木、烤煙云煙87 為接穗，采用盆栽試驗。土壤類型：沙壤土，土和煙草專用育苗基質(zhì)按1 : 1 重量均勻混合，每盆裝土10 kg。供試肥料為煙草育苗專用營養(yǎng)液，氮：磷：鉀為2 : 1 : 2。

1.2 試驗設(shè)計與方法

采用嫁接剪法，選擇長有5～6 片真葉且莖部沒有木質(zhì)化的煙苗和茄子苗進行嫁接，利用嫁接剪剪下接穗，取煙草頂端2 葉一心或3 葉一心作為接穗，砧木距茄子苗根部5 cm 左右剪切，然后將接穗插入砧木切口中，用拇指和食指輕輕壓平，最后用嫁接夾固定。每個處理組合嫁接40 株，嫁接苗進行避光保溫保濕，前3 d 相對濕度90%左右，之后相對濕度80%左右，3 d 之后見光，7 d 后進行正常管理，15 d 后去掉嫁接夾。試驗嫁接組合：云煙87/云煙87、云煙87/茄子。試驗嫁接苗6 月9 日移栽，8 月8 日打頂，移栽15 d 后，選10 株長勢一致的煙茄嫁接組合進行培土，培土高度超過嫁接口5 cm，使其煙株莖稈產(chǎn)生不定根。

試驗采用盆栽方式，共設(shè)3 個處理，3 次重復(fù)，共9 個樣品。處理1：接穗與砧木都為云煙87，用“煙/煙”表示；處理2：云煙87 為接穗，茄子為砧木不進行培土，用“煙/茄不培土”表示；處理3：云煙87 為接穗，茄子為砧木并對煙株進行培土且培土高度高于嫁接口5 cm，用“煙/茄培土”表示。每個處理選擇10 株，3 次重復(fù)，共90 株嫁接煙株。

1.3 樣品制備

煙葉正常成熟采收，各處理選取中部（第7～14葉位）、上部（第15～20 葉位），編竿后掛牌標記，采用三段式烘烤工藝烘烤。各處理調(diào)制后的混合煙葉切絲，一部分卷制成試驗卷煙，用于卷煙煙氣成分測定和感官質(zhì)量評價；一部分煙絲于50℃烘干、研磨，過60 目篩，進行香氣及TSNAs 含量的測定。

1.4 測試項目和方法

1.4.1 TSNAs 的測定

樣品在上海煙草集團北京卷煙廠進行 TSNAs測定。測定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPELC-MS/MS） 法（SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis （Pico）；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。稱 1.0 g 煙樣，放入 50 mL 錐形瓶中，加 40 μL 4 種氘代 TSNAs（內(nèi)標）溶液（5000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L 乙酸銨水溶液，室溫下振蕩（200 r/min）萃取 60 min，萃取液過 0. 45 μm 水相濾膜，LC-MS/MS 檢 測 TSNAs[28]。 總 TSNAs 是 NNN、NNK、 NAT 和 NAB 的含量之和。

1.4.2 卷煙煙氣的測定

樣品在上海煙草集團北京卷煙廠進行卷煙煙氣的測定。用φ44 mm 劍橋濾片逐口捕集30 支卷煙的主流煙氣總粒相物，分別按照GB/T 19609-2004[29]、GB/T 23355-2009[30]、GB/T 23203.1-2008[31]、GB/T 23356-2009[32]和GB/T 21130-2007[33]的方法測定煙氣中的焦油、煙堿、水分、CO。

1.4.3 中性香氣物質(zhì)的測定

采用上海煙草集團技術(shù)中心改進的正己烷常溫萃取前處理方法和LC-GC 方法[34]測定茄酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、氧化紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮（1、2、3、4）、3-羥基-β-二氫大馬酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、新植二烯、3-羥基索拉韋惕酮和法尼基丙酮14 種香氣物質(zhì)的含量。稱取煙末樣品 0.20g 于 15 mL 螺口試管內(nèi)，加 5 mL 正己烷和 200 μL α-紫羅蘭酮內(nèi)標溶液（11.2 μg/mL），渦旋振蕩 1 min，靜置24 h，再次渦旋振蕩，3000 r/min 離心 10 min，取上清液 1～1.5 mL 至色譜樣品瓶待測。

1.4.4 感官質(zhì)量評價

將各處理挑選的中部葉和上部葉的樣品去梗后進行切絲卷制單料煙，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地、河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司評吸專家分別對其進行感官質(zhì)量評價，按照香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、濃度、勁頭、刺激性、余味、燃燒性進行感官質(zhì)量評價，并對滿足感、愉悅感、接受度3 個單項指標打分。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用Duncan 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙茄嫁接對煙葉和煙氣有害成分含量的影響

2.1.1 煙茄嫁接對烤后煙葉TSNAs 含量的影響

如表1 所示。煙茄嫁接中、上部煙葉的NNN、NAT、NAB、NNK 及TSNAs 含 量 與 煙/ 煙 對 照相比存在顯著性差異，其中NNN、NAT、NNK 及TSNAs 含量變化規(guī)律一致，煙/茄不培土處理最低，煙/煙處理最高，上部葉煙/茄不培土處理的NNN、NNK 及TSNAs 含 量 比 煙/ 煙 低82.71%、79.46% 和68.78%，中部葉煙/ 茄不培土處理的NNN、NNK 及TSNAs 含 量 比 煙/ 煙 低79.68%、79.80%和68.63%；NAB 含量變化為煙/茄培土＞煙/茄不培土＞煙/煙，上部葉煙/茄培土比煙/煙高60.10%，中部葉煙/茄培土比煙/煙高60.27%?？俆SNAs 含量降低主要是由NNN 和NNK 含量的降低引起的。

表1 煙茄嫁接對烤后煙TSNAs 含量的影響Tab. 1 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of TSNAs in flue-cured tobacco

2.1.2 煙茄嫁接對卷煙煙氣成分含量的影響

不同處理卷煙煙氣有害成分釋放量的高低在較大程度上反映了煙絲中有害成分或前體物含量的高低，如表2 所示。煙/茄不培土、煙/茄培土和煙/煙3 個處理間的卷煙抽吸口數(shù)、煙氣中總粒相物、焦油和一氧化碳的釋放量無顯著性差異，總粒相物、焦油和一氧化碳釋放量及抽吸口數(shù)表現(xiàn)為煙/煙＞煙/茄培土＞煙/茄不培土；煙/茄不培土和煙/茄培土的煙堿釋放量顯著低于煙/煙處理，煙/茄不培土、煙/茄培土分別比煙/煙低94.12%和92.66%。結(jié)果表明煙茄嫁接可較大程度調(diào)控卷煙煙氣中煙堿釋放量。

表2 煙茄嫁接對卷煙煙氣成分含量的影響Tab. 2 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of composition in mainstream cigarette smoke

2.2 煙茄嫁接對烤后煙中部葉中性香氣物質(zhì)含量的影響

如表3 所示。除巨豆三烯酮2 外，各處理香氣物質(zhì)含量差異達顯著水平，煙/茄不培土和煙/茄培土煙葉中茄酮、香葉基丙酮、氧化紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和3-羥基索拉韋惕酮等香氣物質(zhì)含量顯著增加，煙/茄不培土和煙/茄培土煙葉中β-紫羅蘭酮、3-羥基-β-二氫大馬酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、新植二烯、巨豆三烯酮（1、3、4）和bet-法尼烯等香氣物質(zhì)含量及香氣物質(zhì)總量顯著降低，其中煙/茄不培土與煙/煙處理的香氣物質(zhì)總量無顯著性差異，煙/茄培土與煙/煙處理的香氣物質(zhì)總量有顯著性差異。

表3 煙茄嫁接對烤后煙中部葉中性香氣成分含量的影響Tab. 3 Effect of tobacco and eggplant grafting on content of neutral aroma components in middle tobacco leaves

2.3 煙茄嫁接對烤后煙感官質(zhì)量和消費者反應(yīng)的影響

2.3.1 煙茄嫁接對烤后煙感官質(zhì)量的影響

感官評吸可以直接、準確地評價出煙葉及其制品質(zhì)量的優(yōu)劣。如圖1、圖2 所示，煙茄嫁接對烤后煙中、上部葉感官品質(zhì)的影響效果基本一致，煙/茄培土、煙/茄不培土處理與對照煙/煙處理相比，香氣質(zhì)、濃度、余味、刺激性和燃燒性無顯著差異，香氣量、雜氣、勁頭顯著降低，但仍能感知到一定程度的勁頭。

圖1 煙茄嫁接對烤后煙上部葉感官質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of tobacco and eggplant grafting on sensory quality in upper tobacco leaves

圖2 煙茄嫁接對烤后煙中部葉感官質(zhì)量的影響Fig. 2 Effect of tobacco and eggplant grafting on sensory quality in middle tobacco leaves

2.3.2 煙茄嫁接對消費者反應(yīng)的影響

如圖3 所示，煙茄嫁接的烤后煙中、上部葉對消費者反應(yīng)的影響效果基本一致，與對照煙/煙處理相比，煙/茄培土與煙/茄不培土處理的滿足感、愉悅感、接受度顯著降低，且煙/茄培土與煙/茄不培土兩處理間滿足感、愉悅感、接受度的分值基本一致。結(jié)果表明，煙茄嫁接生產(chǎn)的超低煙堿煙葉對消費者反應(yīng)有顯著影響。

圖3 煙茄嫁接對消費者反應(yīng)的影響Fig. 3 Effect of tobacco and eggplant grafting on response of smoker

3 討論

普通煙草的生物堿以煙堿為主，占總生物堿含量的93%以上[35]。前期研究通過煙茄嫁接可將煙葉煙堿含量降至極低水平，鮮煙葉中煙堿含量低至0.08%，烤后煙煙葉煙堿含量低至0.09%，比煙/煙降低94.81%，且通過培土誘發(fā)不定根產(chǎn)生可以有效調(diào)控?zé)熐鸭藿訜熑~的煙堿含量[27]。上世紀Dawson 在番茄上嫁接的煙草雖然煙堿含量很低，但確能合成部分煙堿，然后用同位素3H 標記的鹽酸注射嫁接的接口部位，證明接穗與砧木的結(jié)合部位確能合成煙堿[36,37]。所以我們初步認為煙茄嫁接煙葉中的少量煙堿可能來自于接穗基部的嫁接部位。大量資料顯示煙苗幼苗煙堿含量在0.3%～0.4%左右[38]，前期研究分別在嫁接后65 d 和80 d 取樣測定煙堿含量分別為0.0834%、0.0804%[27]。有研究表明煙堿在生物體內(nèi)的半衰期為22 h，Yoshida 用15N標記煙堿注入不同發(fā)育階段煙草體內(nèi)，兩周后發(fā)現(xiàn)幼小植株體內(nèi)80%以上標記的煙堿被降解[39-41]。因此嫁接后的成熟煙葉這部分煙堿可能不是來自于煙草幼苗的積累，具體原因需要進一步深入研究驗證。TSNAs 是煙草生物堿發(fā)生硝化反應(yīng)的產(chǎn)物，在煙葉硝態(tài)氮含量和調(diào)制環(huán)境相同的條件下，煙葉煙堿、降煙堿含量與NNN 和TSNAs 含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系[42]。本研究結(jié)果表明，煙茄嫁接后隨著煙堿含量的大幅度降低，NNN、NNK、NAT 和TSNAs 含量顯著降低；而NAB 含量顯著增加，這可能與嫁接煙葉的假木賊堿含量沒有與煙堿含量同步下降，且占總生物堿含量的比例顯著增加有關(guān)[27]。前期研究煙茄嫁接煙葉煙堿含量降低94%左右，但是TSNAs 含量并沒有同比例下降，具體原因需要進一步研究探索，可能是煙葉在生物堿水平較低的情況下，TSNAs 的合成效率比較高。

香氣是反應(yīng)煙葉質(zhì)量的重要品質(zhì)因素，是評定煙葉及其制品品質(zhì)的重要指標，煙草香氣物質(zhì)的代謝包括香氣前體物的合成、降解，香氣成分的形成、轉(zhuǎn)化等過程，中性揮發(fā)性香氣成分對煙葉香氣品質(zhì)有重要貢獻[43]。煙葉煙堿和總氮含量是煙葉內(nèi)在質(zhì)量和感官質(zhì)量的主要影響因子, 烤煙煙堿含量與煙葉香味品質(zhì)和中性香氣物質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)，煙堿含量降低導(dǎo)致煙葉生理強度（勁頭）和滿足感下降，香氣量減少[16,17,41]?；诔Ｒ?guī)育種和化學(xué)萃取的超低煙堿煙葉的品質(zhì)性狀不良,煙葉感官質(zhì)量顯著下降，難以在卷煙配方中使用，消費者接受程度降低[12,13]。而杜詠梅等[44]則認為煙堿為目前制約烤煙吸味品質(zhì)的主要化學(xué)成分，降低煙堿能有效提高烤煙吸味品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，煙茄嫁接生產(chǎn)的超低煙堿煙葉的茄酮、巨豆三烯酮等香氣物質(zhì)含量變化較小，煙葉的香氣物質(zhì)較豐富，煙氣濃度、刺激性和余味等變化較小，但香氣量、勁頭顯著降低，吸煙者的滿足感、愉悅感、接受度顯著降低，這與大多數(shù)研究結(jié)果是基本一致的[16, 17, 41]。

4 結(jié)論

煙茄嫁接的超低煙堿煙葉，中性香氣物質(zhì)含量變化較小，NNN、NNK、NAT 和TSNAs 含量及卷煙煙氣中煙堿的含量大幅降低，卷煙煙氣焦油、CO 和總粒相物等參數(shù)影響相對較小；煙氣勁頭下降明顯，香氣量有所減少，香氣質(zhì)、煙氣濃度、余味、燃燒性和刺激性無顯著差異；消費者滿足感和愉悅感顯著降低。