楊繼，吳億勤，楊柳，雷萍，高茜，申欽鵬，段沅杏，趙楊，陳永寬*，張雙雙，杜巧紅，李暉

1 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，昆明市北市區(qū)紅錦路367號 650231；2 四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，成都市武侯區(qū)一環(huán)路南一段24號 610065

煙堿是煙葉中天然生物堿的主要化學(xué)成分，分子結(jié)構(gòu)（圖1a）是由兩個氮雜環(huán)構(gòu)成，吡咯環(huán)pKa=7.87，吡啶環(huán)pKa=3.15。吡啶環(huán)中的氮原子由于芳香化的影響，堿性很弱，與芳胺的堿性相近。吡咯烷環(huán)中的氮原子屬于叔胺，由于此環(huán)沒有芳香化，其堿性與脂肪族叔胺堿性相近，所以，煙堿易和酸進行化學(xué)反應(yīng)。已有報道指出，煙堿在煙葉中主要以檸檬酸、蘋果酸等有機酸鹽的形式存在[1]；煙堿與硅鎢酸作用生成煙堿硅鎢酸[2]。這些結(jié)果說明，合成煙堿的有機酸鹽，代替單體煙堿，用于制品配方，研發(fā)新型煙草制品的技術(shù)路線是可行的。而且結(jié)合態(tài)的煙堿不僅可以改善口感，而且影響煙堿的溶出行為，能持續(xù)提供生理滿足感和口感。最近，據(jù)《國際煙草》和煙業(yè)通訊網(wǎng)報道，美國帕克斯實驗室推出一款新的智能電子煙，該電子煙是以“尼古丁鹽”為核心原料，而非傳統(tǒng)電子煙中游離態(tài)的煙堿。美國杜克大學(xué)Jed E. Rose 教授成功合成了煙堿丙酮酸鹽，并進行了相關(guān)藥代動力學(xué)方面的研究[3]。同時，有關(guān)煙堿酒石酸鹽[4]，水楊酸和煙堿共晶體的相關(guān)研究也有報道[5]。煙堿與有機酸成鹽，使得煙堿以固態(tài)形式存在，相較于易揮發(fā)且易被氧化的煙堿單體[6]，固體煙堿鹽具有良好的儲藏穩(wěn)定性。煙堿的不同存在形式（包括煙堿鹽），對煙堿的釋放以及跨膜滲透速率有不同的影響[7]。有研究表明，質(zhì)子態(tài)的煙堿相較于中性游離態(tài)煙堿，由于分配系數(shù)以及擴散率更小，在口腔粘膜中的滲透速率小[8]；煙堿的質(zhì)子化可以減緩煙堿的透膜擴散，改善煙堿在體內(nèi)的代謝行為[9]。因此，利用固體有機酸固化液態(tài)煙堿，形成煙堿的固態(tài)鹽形式，可以作為新的煙堿引入形式，應(yīng)用于新型煙草制品的研發(fā)。

龍膽酸（gentisic acid），即2, 5-二羥基苯甲酸（圖1b），是一種多羥基酸，具有解熱鎮(zhèn)痛的功效[10]，也用作醫(yī)藥中間體，易與堿性物質(zhì)成鹽。本文利用化學(xué)合成方法，制備煙堿龍膽酸鹽，培養(yǎng)單晶體，解析其其結(jié)構(gòu)。將制備的煙堿龍膽酸鹽作為模型分子，利用藥物透皮擴散技術(shù)，以離體豬口腔頰黏膜為載體，研究了不同酸堿度下煙堿龍膽酸鹽的跨膜擴散行為，并和純煙堿進行了對比，對其煙堿的釋放規(guī)律進行了探究。本研究可為無煙制品配方設(shè)計、改進及應(yīng)用提供實驗和理論參考。

圖1 （a）煙堿分子結(jié)構(gòu)（b）龍膽酸分子結(jié)構(gòu)Fig.1 (a) Molecular structure of nicotine (b) Molecular structure of gentian acid

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

1.1.1 試劑

煙堿標準從由陜西港華生物科技有限公司購置，純度99%（HPLC 純度）；龍膽酸（純度99%）由成都市科龍化工試劑廠購置；甲醇（色譜純）由德國默克密理博試劑公司購置；其他所用試劑均為分析純。水為高純水，由Millipore Synergy 超純水系統(tǒng)制備。

1.1.2 儀器

X- 射線單晶衍射儀：CCDX-caliburNova 型，牛津衍射有限公司；高效液相色譜儀：Agilent 1200 series（美國安捷倫科技有限公司）；pH 計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；METTLER TOLEDO 分析天平：感量0.0001 g，德國METTLER TOLEDO 公司；13 mm×0.45 μm 水相針式濾器：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；HY-8 調(diào)速振蕩器：常州國華電器有限公司；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。Milli-Q50 超純水儀：美國MILLIPORE 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙堿龍膽酸鹽的制備

取0.95 g 龍膽酸于錐形瓶中，加入5 mL 乙醇使其完全溶解，再加入15 mL 的超純水，攪拌至混合均勻。對錐形瓶進行遮光處理后，置于恒溫攪拌器中，在充分攪拌下滴加1.01 g煙堿，控制反應(yīng)溫度為35 ℃，30 min 滴加完畢?？刂迫芤簆H 在5.5～6.0 之間攪拌至反應(yīng)結(jié)束。

過濾反應(yīng)后所得溶液，將濾液置于常溫避光處靜置24 h 后，溶液轉(zhuǎn)移至真空干燥箱。在溫度35℃、真空度0.8 MPa 條件下進行真空干燥，一周后得到棕黃色粘稠液體。黃色粘稠液體在常溫避光下進行晶體培養(yǎng)，數(shù)周后得到棕黃色透明針狀晶體。

1.2.2 單晶結(jié)構(gòu)測定

選擇尺寸大小合適的棒狀晶體，利用CCD Xcalibur E 型X-射線單晶衍射儀（瑞士Bruker 公司）進行X-射線單晶衍射測試。MoKα 輻射，λ = 0.71073，293K，θ 掃 描 范 圍3.13-26.37°。Olex2-1.1 （SHELX-97）軟件包用于結(jié)構(gòu)解析與精修。

1.2.3 煙堿定量分析方法

準確移取50 μL 煙堿標準品于5.0 mL 棕色容量瓶，用超純水稀釋，超聲處理約2.0 min 后準確定量至5.0 mL，制備成煙堿濃度為101 mg/mL 的儲備液。配制煙堿系列濃度，檢測波長設(shè)定為259 nm，瑞典Kromasil C18 色譜柱（250×4.6 mm i.d），繪制工作曲線。線性關(guān)系為：y=10786.1x-69.9，R2=0.9999。測定煙堿龍膽酸鹽中煙堿含量測定時，準確稱取所制備的煙堿龍膽酸鹽5.08 mg，于5.0 mL 帶塞的棕色容量瓶中，滴加適量3 次蒸餾水使其溶解。超聲約10 min 后，用3 次蒸餾水定容至刻度，搖勻得濃度分別為1.016 mg/mL 的煙堿龍膽酸鹽樣品溶液。分析前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，直接進樣測定。

1.2.4 跨膜擴散實驗樣品制備

人工模擬口腔唾液配方見表1，準確稱取表1 中各物質(zhì)，溶于1L 超純水中，待溶解完全后即得模擬唾液儲備液。分別取一定量模擬唾液儲備液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH，調(diào)至pH=6.7 和pH=5.5，得到pH 分別為6.7 和5.5 的模擬唾液儲備液。準確取煙堿200 mg 兩份以及當量的煙堿龍膽酸鹽（452 mg）兩份，分別用對應(yīng)pH 的模擬唾液儲備液溶解，加入一定量稀鹽酸使得最終定容后溶液pH 為6.7 和5.5，并用對應(yīng)pH的儲備液定容于100 mL 容量瓶，得到pH 分別為6.7和5.5 的2 mg/mL 煙堿儲備液和煙堿龍膽酸鹽儲備液。準確取煙堿100 mg 兩份以及當量的煙堿龍膽酸鹽（226 mg）兩份，分別用對應(yīng)pH 的模擬唾液儲備液溶解并定容于100 mL 容量瓶，并加入微量稀鹽酸調(diào)節(jié)其pH 至6.7 和5.5，得到pH 分別為6.7 和5.5的1 mg/mL 煙堿儲備液和煙堿龍膽酸鹽儲備液。

1.2.5 煙堿龍膽酸鹽跨膜擴散實驗

統(tǒng)一選取體質(zhì)量為（110±5） kg 的健康生豬進行口腔頰黏膜采集。選取當天屠宰且未經(jīng)開水燙過的新鮮豬首，剪下豬首口腔中頰膜連帶肌肉組織，剝離皮下脂肪層和結(jié)締組織，獲得約4×4 cm2大小的頰黏膜。選取光滑正常（未出現(xiàn)紅腫、潰瘍等病態(tài)）且表面干凈無異物的口腔粘膜，用生理鹽水沖洗2 次后，浸泡在生理鹽水中，并做好標記。采集的頰黏膜厚度通常在2.0～3.0 mm 之間，如圖2 所示，實驗前對黏膜不光滑一側(cè)進行再次切割，使得黏膜厚度控制在（1.0±0.1） mm。每次實驗均使用新鮮的豬口腔頰黏膜，為保證的實驗一致性，實驗前離體時間控制在（6 ± 0.5） h，并且為保持其活性，用Krebs 液平衡1.5 h[11]。Krebs 液是一種用于模擬生理條件的體外營養(yǎng)液或灌流液[12]，其組成見表1。

圖2 采集的豬口腔頰粘膜Fig.2 Buccal mucosa of pig mouth

表1 Krebs 液配方Tab.1 Formula of Krebs solution

采用TP-6 型藥物透皮擴散試驗儀進行煙堿的跨口腔黏膜擴散研究。實驗過程中，將采集的新鮮豬口腔頰黏膜夾在擴散池（供給池）與接受池之間，光滑的頰膜外側(cè)朝向煙堿供給池，有褶皺頰膜內(nèi)側(cè)表面沉浸在接受介質(zhì)中[9,11]。準確移取6 mL 樣品儲備液（煙堿單體儲備液、煙堿龍膽酸鹽儲備液）置于擴散池，6 mL 具有相同pH 的空白模擬唾液置于接受池，在（37±0.5）℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速350 rpm 下進行跨膜擴散實驗。在時間梯度為（0，2，4，6，8，10，12，15，20，30，40，50，60 min）下，從接受池中抽取500 μL 樣品溶液，并補加相應(yīng)體積相同pH 的模擬唾液介質(zhì)。每一組對照實驗同時進行，12 組平行實驗分12 批進行。在進行煙堿樣品的跨膜擴散實驗時，同步進行擴散池中無煙堿的空白實驗，以最大程度排除豬口腔黏膜在擴散過程中釋放的物質(zhì)對煙堿含量測定的影響。按1.2.3 測得煙堿濃度,代入下式計算煙堿累積滲透量Q（mg/cm2）[13-14]：

式中Q 為累積透過量（μg/cm2）；V 為接受池中接收液的體積（mL）；Cn為第n 個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL）； S 為有效擴散面積（cm2）（本研究中S=3.14 cm2）。

以藥物累積滲透量Q 為縱坐標，以時間t 為橫坐標作圖,可以得到煙堿累積滲透量與擴散時間的關(guān)系圖。對所得數(shù)據(jù)進行線性回歸得到Q 關(guān)于t 線性方程，其斜率即為煙堿跨口腔黏膜擴散的穩(wěn)態(tài)滲透速率Jss （μg/cm2/min）。

此外，煙堿的表觀滲透系數(shù)Papp(cm/s)與其穩(wěn)態(tài)滲透速率（Jss）及供給室的煙堿濃度C0通常存在如下關(guān)系：

由方程（2）即可求得煙堿的表觀滲透系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙堿龍膽酸鹽形貌晶體結(jié)構(gòu)分析

龍膽酸晶體結(jié)構(gòu)（圖3）顯示，晶體整體呈片層結(jié)構(gòu)，每一層呈波浪形展開，層與層之間上下錯落有致，其形貌正好與后續(xù)的晶體堆積結(jié)果形成相互驗證。

2.2 煙堿龍膽酸鹽晶體結(jié)構(gòu)分析

X-射線單晶衍射結(jié)構(gòu)分析表明，煙堿龍膽酸鹽由1 個加氫的煙堿陽離子（一價）與1 個龍膽酸根離子（一價）組成。該化合物屬單斜晶系，單個分子相對分子質(zhì)量為316.35，P21空間群，密度為1.342 g/cm3。晶胞參數(shù)和結(jié)果氫鍵分別見表2 和表3，晶體結(jié)構(gòu)如圖4 所示，晶體結(jié)構(gòu)堆積圖如圖5，原子編號見圖6。

圖3 煙堿龍膽酸鹽晶體光學(xué)顯微形貌（放大100 倍）Fig. 3 Optical microscopic morphology of nicotinic gentisate crystal (100 times magnification)

圖4 煙堿龍膽酸鹽單晶晶體結(jié)構(gòu)Fig. 4 Single crystal structure of nicotinic gentisate

表2 晶體數(shù)據(jù)Tab. 2 Crystal data

表3 煙堿龍膽酸鹽中氫鍵鍵長鍵角結(jié)果Tab. 3 Results of hydrogen bond length and bond angle in nicotinic gentisate

圖5 煙堿龍膽酸鹽晶體結(jié)構(gòu)堆積圖Fig. 5 Accumulation diagram of nicotinic gentisate crystal structure

圖6 煙堿龍膽酸鹽晶體結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 Crystal structure of nicotinic gentisate

化合物通過離子鍵緊密結(jié)合，煙堿吡咯環(huán)上的氮（N2）結(jié)合一個龍膽酸的羧基氫（H2），整體帶一個正電荷，且通過氫鍵N2-H2···O1 與一個龍膽酸根離子相連，形成1:1 的煙堿龍膽酸鹽。

煙堿吡咯環(huán)上的氫（H16B）與旁邊的煙堿吡啶環(huán)上的氮（N1）通過氫鍵C16-H16B···N1 結(jié)合；龍膽酸的羥基氫（H4）與旁邊龍膽酸羧基上的雙鍵氧（O2）通過氫鍵O4-H4·O2 結(jié)合。晶體結(jié)構(gòu)以煙堿（藍色）/龍膽酸（黑色）1:1 結(jié)合為最小單元，煙堿分子之間通過氫鍵依次結(jié)合，且吡咯環(huán)中心處于同一平面，與煙堿結(jié)合的龍膽酸依次上下交替排列，嵌插在2 個煙堿平面之間，且相鄰的龍膽酸分子之間以氫鍵相互結(jié)合。

2.3 煙堿龍膽酸鹽含量的測定

利用所建HPLC 分析方法，測定煙堿龍膽酸鹽中煙堿的含量。色譜結(jié)果如圖7所示。樣品連續(xù)測定3次，記錄其煙堿峰面積并計算其平均值為4752.5 mAU。圖7 顯示，煙堿在8.0 min 左右出峰，在約3.0 min 時觀察到一微弱的吸收峰，經(jīng)鑒定為殘留的未成鹽的游離龍膽酸。根據(jù)標準曲線方法，計算出煙堿龍膽酸鹽中煙堿的體積平均濃度為0.447 mg/mL，質(zhì)量平均濃度為0.443 mg/mg。

圖7 煙堿龍膽酸鹽的HPLC 色譜圖Fig. 7 HPLC chromatogram of nicotinic gentisate

2.4 煙堿龍膽酸鹽跨膜擴散特性研究

按照1.2.5 實驗操作進行取樣及測定，扣除空白后測定煙堿含量，繪制不同pH 和初始煙堿單體及煙堿-龍膽酸鹽濃度和跨膜擴散接受池中煙堿濃度-時間關(guān)系曲線，結(jié)果如圖8 所示。

圖8 不同pH 和濃度下煙堿龍膽酸鹽跨膜擴散接受池煙堿濃度-時間曲線Fig. 8 Nicotine concentration-time curves of nicotinic gentisate in transmembrane diffusion acceptor

由圖8 可知，在pH5.5 和pH6.7 兩種擴散介質(zhì)中，煙堿龍膽酸鹽和煙堿單體接收池內(nèi)的煙堿濃度均隨著時間延長，表現(xiàn)出顯著增加的趨勢。由于豬口腔粘膜狀態(tài)存在一定的差異，擴散開始前15 min 內(nèi)，煙堿透過粘膜屏障過程還沒有達到穩(wěn)態(tài)，因而各條件下煙堿及煙堿龍膽酸鹽未表現(xiàn)出各自的擴散特性。對比15 min 后各條件下接收池中煙堿濃度可以得出，一定初始濃度以及pH 條件下，煙堿龍膽酸鹽的擴散速率明顯低于相應(yīng)初始濃度及pH 條件下煙堿單體的擴散速率，說明煙堿龍膽酸鹽具有緩釋煙堿的特性。同時，對比煙堿單體在不同pH 下的擴散情況可知，隨著介質(zhì)pH 值的減小，煙堿的跨膜擴散速率減小。這是由于煙堿在溶液中以中性煙堿分子、單質(zhì)子態(tài)煙堿正離子和雙質(zhì)子態(tài)煙堿正離子3 種形態(tài)存在；而質(zhì)子態(tài)的煙堿與中性煙堿分子透過口腔粘膜的方式存在差異，導(dǎo)致質(zhì)子態(tài)的煙堿透膜速率低于中性煙堿分子[8]。隨著溶液pH 的減小，煙堿質(zhì)子化程度加大，從而透過口腔粘膜的速率減小。對比煙堿龍膽酸鹽在不同pH條件下的透膜擴散濃度曲線可知，相較于pH6.7 的介質(zhì)環(huán)境，煙堿龍膽酸鹽在pH5.5 的介質(zhì)中表現(xiàn)出更為緩慢的釋放特性，說明介質(zhì)pH 越低，煙堿龍膽酸鹽對煙堿的緩釋效果更突出。分析不同初始濃度下的擴散情況可知，煙堿龍膽酸鹽在不同初始濃度下，對煙堿的緩釋效果也表現(xiàn)出一定程度的差異。綜合上述豬口腔跨膜擴散結(jié)果，煙堿龍膽酸鹽具有顯著的緩釋煙堿擴散的效果，且緩釋效果與介質(zhì)pH 和煙堿鹽的初始濃度有關(guān)。

同上，各取樣點對應(yīng)的煙堿平均累積滲透量結(jié)果見表4。根據(jù)表4 數(shù)據(jù)，線性回歸得到不同pH 下的Q-t 線性關(guān)系及煙堿龍膽酸鹽跨膜擴散的穩(wěn)態(tài)滲透速率（Jss），并由方程（2）可計算出煙堿表觀滲透系數(shù)（Papp），結(jié)果見表5。

煙堿累積滲透量與擴散時間的關(guān)系圖，見圖9。結(jié)合圖9 及表5 的結(jié)果可知，在pH5.5 和pH6.7 介質(zhì)中的表觀滲透系數(shù)均大于2×10-6，說明煙堿龍膽酸鹽在該pH 范圍內(nèi)的滲透性較好，容易跨膜擴散。在相同的初始濃度條件下，煙堿龍膽酸鹽在pH5.5 介質(zhì)中的穩(wěn)態(tài)滲透速率小于pH6.7 介質(zhì)中的穩(wěn)態(tài)滲透速率，表明，煙堿龍膽酸鹽在低pH 介質(zhì)中具有相對偏慢的滲透速率，即具有更為顯著的緩釋特性。在相同pH 條件下，表現(xiàn)出初始濃度越高，穩(wěn)態(tài)滲透速率越大，即跨膜擴散越快?？傮w來看，煙堿單體在兩種pH 環(huán)境下均表現(xiàn)出良好的跨膜擴散特性，煙堿龍膽酸鹽具有明顯的緩釋擴散特性，且在低pH 介質(zhì)中緩釋效果更為顯著。

表4 不同pH 及濃度下的煙堿龍膽酸鹽接受池中煙堿平均累積滲透量（n= 12）Tab. 4 The average cumulative nicotine permeability of nicotinic gentisate at different pH and concentration in transmembrane diffusion acceptor（n= 12）

表5 不同pH 及濃度下煙堿龍膽酸鹽的煙堿跨膜擴散穩(wěn)態(tài)滲透速率及表觀滲透系數(shù)Tab. 5 Permeability rate and apparent permeability coefficient of nicotine transmembrane diffusion of nicotinic gentisate at different pH and concentration

2.5 基于煙堿龍膽酸鹽的產(chǎn)品開發(fā)

目前大多數(shù)無煙氣煙草制品煙堿引入方式主要是通過直接添加煙堿或煙草粉末，這會帶來三方面的主要問題：一是勁頭過大引起消化道的不適；二是釋放過快不能提供持續(xù)長效的生理滿足感；三是口感較差，刺激性大。從以上研究可以看出，煙堿龍膽酸鹽具有明顯的緩釋擴散特性，在無煙氣煙草制品開發(fā)中可以將其作為煙堿的替代形式，豐富產(chǎn)品的配方設(shè)計。新煙堿形式的引入，可以減緩煙堿的釋放速率，延長生理滿足感和口感，可在一定程度上調(diào)控煙草制品本身的苦澀感。

3 結(jié)論

成功合成了煙堿龍膽酸鹽，培養(yǎng)獲得單晶體，首次報道了該鹽的晶體結(jié)構(gòu)。龍膽酸的羧基部分與煙堿發(fā)生反應(yīng)，生成由1 個加氫煙堿陽離子與1 個龍膽酸根離子組成的煙堿龍膽酸鹽。體外模擬口腔環(huán)境的跨膜擴散實驗表明了煙堿龍膽酸鹽具有顯著的緩釋擴散效果。本研究可為新型煙草制品研發(fā)新的煙堿引入形式提供參考和借鑒，為打造新型煙草技術(shù)新優(yōu)勢提供支撐。