周 宏，李名聰，顧亞男，朱婷婷，羅 欣，張勝權

皮膚覆蓋于人體表面，是人體最大的器官之一。皮膚由表皮和真皮兩部分組成，其中表皮的關鍵功能是在生物體和外界之間形成屏障，對人體有重要的保護作用。皮膚角質形成細胞(keratinocytes, KCs)是表皮的主要組成部分[1]。甲羥戊酸途徑是細胞重要的代謝途徑，其通過合成甾醇類異戊二烯(如：膽固醇)和非甾醇類異戊二烯在多種細胞過程中起關鍵作用[2]。甲羥戊酸途徑的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物包括：甲羥戊酸(mevalonic,MVA)、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)、香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)、膽固醇(cholesterol,CH)等[3]。膽固醇是細胞膜系統(tǒng)的組成成份，在體內(nèi)可進一步轉化成重要的生理活性物質,如膽汁酸、類固醇激素及維生素D(vitaminD，VitD)[4]。FPP和GGPP可以提供異戊烯基給小G蛋白的脂化過程，通過活化蛋白來影響細胞代謝途徑[5]。研究[6-7]表明法尼基轉移酶抑制劑 (farnesyltransferase inhibitor,FTI)-277和香葉基香葉基轉移酶抑制劑(geranylgeranyl transferase inhibitor,GGTI)-298的組合模擬了他汀類介導的細胞外調(diào)節(jié)蛋白酶(extracellular regulated protein kinases5,ERK5)激活內(nèi)皮保護機制。香葉基香葉醇能夠阻斷細胞凋亡，香葉基香葉基化參與了蛋白質的凋亡途徑[8-9]?，F(xiàn)使用FTI-277和GGTI-298作用于KCs，初步探討其對KCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗試劑從外科手術獲得的皮膚中分離出KCs；M154CF 培養(yǎng)基、Coating Matrix基質、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和neutral protease(中性蛋白酶)(美國Gibco公司)；青霉素鏈霉素溶液、RIPA裂解液和細胞周期試劑盒(上海碧云天生物公司)；MTS試劑盒及抑制劑FTI和GGTI(美國sigma公司)；CyclinB1、CyclinE及β-actin(美國abcam公司)；P21、p-AKT、p-ERK1/2(美國Santa Cruz公司)；所有使用的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 在無菌條件下，用70%乙醇漂洗手術中取得的患者包皮組織。在無血清的培養(yǎng)基清洗數(shù)次以去除表面細菌。用已高溫滅菌的鑷子和剪刀將皮膚組織剪成多個小塊，反復用無血清的培養(yǎng)基沖洗數(shù)次，轉移至中性蛋白酶中，4 ℃消化過夜。第2天取出充分消化的皮膚組織剝離表皮層，加入0.025%胰蛋白酶消化5 min。然后用無菌注射器鈍頭在200目細胞篩上研磨，用無菌無血清的培養(yǎng)基反復沖洗，將所得液體離心，用M154培養(yǎng)基緩慢吹打形成KCs懸液，在細胞培養(yǎng)瓶中接種，37 ℃、5% CO2恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2細胞活力測定實驗(MTS) 在96孔板中預先鋪上Coating Matrix，再接種KCs細胞(0.025%胰酶消化收集)，每孔100 μl(6×104/ml)，均勻鋪板，直到細胞密度達到70%～80%，分別加入藥物FTI(使終濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μmol/L)、GGTI(使終濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μmol/L)，同時設置對照組(0 μmol/L)。2 d后，每孔加20 μl MTS試劑混勻，37 ℃、5% CO2孵育3～4 h后，酶標儀檢測在490 nm處的吸光度，實驗重復3次。

1.2.3細胞周期檢測 在6孔板中預先鋪上Coating Matrix，再接種KCs細胞(0.025%胰酶消化收集)，密度為5×104/ml，孵箱中孵育，直到細胞密度達到70%～ 80%，分別加入藥物：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)，并設置對照組(0 μmol/L)。2 d后，收集KCs(0.025%胰酶消化)，室溫下，按照細胞周期試劑盒的說明書操作，避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期，F(xiàn)lowjo軟件分析細胞周期，實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測蛋白P21、CyclinB1和CyclinE的表達 在24孔板(2×105/孔)中預先鋪上Coating Matrix，再接種KCs細胞(0.025%胰酶消化收集)，直到細胞密度達到70%～80%，分別加藥：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)，并設置對照組(0 μmol/L)。2 d后，收集KCs細胞(0.025%胰酶消化)，從細胞中提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，配制適當濃度的膠，每孔加入10 μl上樣，然后電泳，恒壓60 V電泳45 min，加壓到120 V恒壓電泳1 h，轉膜(恒流300 mA，1.5 h)，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(CyclinB1、CyclinE及β-actin濃度1 ∶1 000，P21、p-AKT、p-ERK1/2濃度1 ∶500)孵育2 h，洗膜，常溫搖床孵育二抗(濃度1 ∶10 000)2 h，用Thermo Super Signal West Trial Kit化學發(fā)光底物顯影，分析目的蛋白的表達情況。

2 結果

2.1 FTI和GGTI能抑制KCs增殖隨著FTI、GGTI藥物濃度的增加，細胞活力呈下降趨勢，當FTI藥液濃度為5 μmol/L、GGTI藥液濃度為5 μmol/L時KCs細胞相對活力最小，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1A。KCs細胞分別被FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)單獨處理時，F(xiàn)TI處理組的KCs細胞活力為85.3%，GGTI處理組的KCs細胞活力為75.5%，F(xiàn)TI和GGTI均能抑制KCs細胞增殖，抑制率分別為14.7%、24.5%(F=305.418，P<0.01)，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。見圖1B。

圖1 FTI和GGTI單獨處理對KCs增殖抑制作用A：不同濃度的FTI、GGTI單獨作用KCs細胞2 d后對細胞增殖的影響；B：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)單獨處理KCs后對其增殖影響；與空白對照組比較：**P<0.01

2.2 FTI和GGTI對KCs細胞周期G1期的阻滯效應不明顯FTI、GGTI單獨處理KCs細胞時，對細胞G1期阻滯作用均不明顯。見圖2。

2.3 GGTI、FTI單獨處理KCs對細胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE和P21表達的影響GGTI單獨處理KCs后，與空白對照組相比，GGTI加藥組CyclinB1表達下調(diào)(F=358.748，P<0.01)，CyclinE的表達上調(diào)(F=16.684，P<0.05)；同時FTI單獨加藥組CyclinB1表達下調(diào)(F=15.065，P<0.05)，CyclinE的表達上調(diào)(F=78.880,P<0.01)；GGTI、FTI單獨加藥組均能上調(diào)P21的表達(F=348.004，P<0.01)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。見圖3A、B。

圖2 流式細胞術檢測細胞周期

圖3 FTI和GGTI單獨用藥對KCs細胞周期蛋白表達的影響A：各加藥組對KCs細胞周期蛋白的影響；B：各加藥組蛋白表達的灰度分析；a:空白對照組;b:GGTI加藥組;c:FTI加藥組；與空白對照組相比較：*P<0.05,**P<0.01

2.4 FTI、GGTI單獨處理KCs對PERK1/2、PAKT表達的影響FTI、GGTI分別單獨處理KCs后，PERK1/2的表達下調(diào)(F=89.980，P<0.01)，pAKT的表達上調(diào)(F=37.709，P<0.01)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。見圖4A、B。

3 討論

皮膚的屏障結構和功能對人體健康至關重要。表皮角質形成細胞的功能表明，皮膚在使全身生理適應不斷變化的環(huán)境中起著重要作用[10]。甲羥戊酸途徑對細胞影響重大，是細胞最重要的代謝途徑之一[11]。甲羥戊酸激酶對KCs的增殖、分化、凋亡及相關信號途徑有重要的影響[12]。

圖4 FTI和GGTI單獨用藥對KCs信號途徑蛋白表達的影響A：各加藥組單獨處理KCs對信號途徑蛋白的影響；B：蛋白表達的灰度分析；a:空白對照組;b:GGTI加藥組;c:FTI加藥組；與空白對照組相比較：**P<0.01

本研究表明，F(xiàn)TI和GGTI對KCs的增殖有抑制作用，可能是在甲羥戊酸代謝途徑中，F(xiàn)TI對FPP、GGTI對GGPP抑制下游反應進行，導致其積累上游產(chǎn)物MVA、FPP、GGPP，缺失下游產(chǎn)物CH，上游產(chǎn)物累積和下游產(chǎn)物CH缺失都可能引起細胞代謝紊亂。P21抑制細胞周期從G1/S期[13]，CyclinE過表達會停留在G1期[14]，降低CyclinB1阻滯細胞于G2/M期[15]。FTI和GGTI降低了CyclinB1的表達，與此同時CyclinE、P21的表達得到了增強。此外，MAPK是接受膜受體轉換與傳遞的信號并將其帶入核內(nèi)的重要途徑，在許多細胞增殖相關信號通路中具有關鍵作用。P13K-AKT參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。從而探討了MAPK和P13K-AKT兩個代謝途徑中KCs增殖的影響，分別單獨補充FTI、GGTI這兩種抑制劑，與空白對照組相比，均表現(xiàn)為pERK1/2下調(diào)且pAKT的上調(diào)。然而這兩種信號途徑相當復雜，其影響的具體方式和途徑還有待討論。

所以，F(xiàn)TI和GGTI對皮膚角質形成細胞的增殖均有抑制作用。根據(jù)本研究結果，推測甲羥戊酸代謝途徑中膽固醇合成受到影響，破壞皮膚細胞正常增殖。本實驗僅為體外細胞研究，可以此為基礎，構建甲羥戊酸代謝途徑相關基因的動物模型，通過體外和體內(nèi)兩角度來研究甲羥戊酸代謝途徑紊亂對皮膚表型的影響及其相關分子機制的研究。