孫志偉 張啟明 苑舉民 何仲秋 姜斌 閆慧峰 王樹聲

摘??要：為快速、無損、準(zhǔn)確地估計煙草葉綠素含量，通過品種和氮素水平雙因素試驗(yàn)，獲得葉片數(shù)字圖像和葉片葉綠素含量數(shù)據(jù)集，分析葉片可見光譜參數(shù)與葉綠素含量參數(shù)間的關(guān)系并選擇最佳參數(shù)建立估測模型。結(jié)果表明，烤煙品種和氮素水平互作增加了葉綠素與光譜參數(shù)的變異性;在3類顏色指標(biāo)中，NRI、R/（G+B）、（R-B）/G、（G-R）/（R+G+B）、（R-B）/（R+G+B）、ExR與葉綠素指標(biāo)達(dá)到極顯著相關(guān)（p<0.01），其中R/（G+B）與Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.632、-0.636、-0.666，相關(guān)性表現(xiàn)最好;利用田間試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，R/（G+B）對葉綠素指標(biāo)的預(yù)測精度最高，與Chl.a、Chl.b、Chl（a+b）之間的均方根誤差值分別為0.6069、0.1567、0.7575;選擇R/（G+B）作為葉綠素含量估測的最佳顏色指標(biāo)。利用該方法可實(shí)現(xiàn)智能手機(jī)對煙草葉綠素含量進(jìn)行快速測定，及時指導(dǎo)煙田施肥和采取合適的栽培管理措施，具有可期的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：烤煙;可見光譜;葉綠素含量;顏色指標(biāo);方程模型

Estimation Model of Chlorophyll Content in Tobacco Based on Visible Spectroscopic Parameters

SUN?Zhiwei¹，?ZHANG Qiming²，?YUAN Jumin²，?HE Zhongqiu¹，?JIANG Bin³， YAN Huifeng^1*，?WANG Shusheng^1*

（1.Tobacco Research Institute of CAAS， Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Qingdao 266101， China;?2. Jiangxi Institute of Tobacco Science， Nanchang 330025， China; 3. Shandong Branch of China National Tobacco Corporation， Jinan 250101， China）

Abstract：In order to estimate the chlorophyll?content of tobacco quickly， nondestructively and accurately， the relationship between visible spectral parameters and chlorophyll?content parameters was analyzed by designing?a?two-factor experiment of variety and nitrogen level， and the best parameters were selected to establish the estimation model. The results of nutrient solution culture showed that the interaction between flue-cured tobacco varieties and nitrogen levels increased the variability of chlorophyll?and spectral parameters. However， among the three color indices， NRI，R/（G+B）， （R-B）/G， （G-R）/（R+G+B）， （R-B）/（R+G+B） and ExR were significantly correlated with chlorophyll indices （p<0.01）. The correlation coefficients betweenR/（G+B） and Chl.a， Chl.b and Chl（a+b） were -0.632， -0.636， -0.666， respectively， with the best correlation performance. Field experiments confirmed?thatR/（G+B） had the highest accuracy in predicting chlorophyll?content， and it was chosen as the best color index for estimating chlorophyll?content. The RMS errors betweenR/（G+B） and Chl.a， Chl.b and Chl（a+b） were 0.6069， 0.1567 and 0.7575， respectively. With this method， chlorophyll?content of tobacco can be rapidly determined by smart phone， and the fertilization and cultivation management measures can be timely guided. It has a promising application potential.

Keywords： flue-cured tobacco; visible spectrum; chlorophyll?content; color index; equation model

葉綠素為植物葉片中的吸光物質(zhì)，是植物和外界發(fā)生能量轉(zhuǎn)化的重要條件^[1]。葉綠素與葉片氮濃度、氮肥施用量和產(chǎn)量相關(guān)^[2]，因此常常利用葉綠素含量來估測作物氮素的營養(yǎng)狀況。葉綠素含量也與葉片顏色有關(guān)^[3]，葉色是高等植物常見的可見形態(tài)特征，通過葉色的變化可判斷作物生長發(fā)育情況。

傳統(tǒng)的葉綠素含量測定方法有兩種，一是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的化學(xué)分析，其優(yōu)點(diǎn)是能夠準(zhǔn)確測定葉片中葉綠素含量，缺點(diǎn)是其為破壞性的測定，且需要一定的試驗(yàn)條件，測定耗時較長，不能實(shí)現(xiàn)快速測定^[4]。二是用SPAD儀實(shí)時測定葉片的SPAD值表征葉綠素含量的相對值，優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)葉綠素的無損快速測定，但SPAD儀缺點(diǎn)為測定變異性大，需要進(jìn)行多點(diǎn)測定來降低變異性，且受作物品種和生育期的影響較大，購買SPAD儀價格較貴，生產(chǎn)上推廣應(yīng)用有一定的難度^[5]。

植物光譜診斷是基于植物的光譜特性來反映植物的生理生化特征和化學(xué)成分的變化^[6]。植物的光譜特性與葉片結(jié)構(gòu)和色素含量有關(guān)，與植物營養(yǎng)狀況也密切相關(guān)。近年來，科學(xué)家進(jìn)行了大量估測植物葉片葉綠素含量的研究，刑雪霞等^[7]研究表明，光譜參數(shù)TCARI與烤煙葉綠素、類胡蘿卜素含量有較好的相關(guān)性。水稻和冬油菜^[8-9]的研究表明NRI與SPAD值、葉片氮含量之間的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，蘇永士等^[10]研究表明，利用高光譜儀獲取的GNDVI與烤煙葉綠素含量和葉面積指數(shù)有良好的相關(guān)性。

以上研究都采用不同手段將數(shù)字圖像參數(shù)與作物營養(yǎng)狀況進(jìn)行了分析。本文旨在研究煙草葉綠素含量與不同顏色特征參數(shù)之間的關(guān)系，篩選對煙草葉綠素含量的敏感參數(shù)，確定煙草葉綠素含量的估算模型，為快速、準(zhǔn)確地定量估測烤煙葉片葉綠素含量提供有效的方法，也為烤煙生長狀況的實(shí)時監(jiān)測提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)分為營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn)和田間試驗(yàn)兩部分進(jìn)行，營養(yǎng)液試驗(yàn)用于篩選顏色參數(shù)，建立估算模型，田間試驗(yàn)用于模型反演，確定估算模型的適用性。

營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn)于2018年7月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨實(shí)驗(yàn)基地溫室進(jìn)行。品種和氮水平兩因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，烤煙品種為云煙87、NC55、K326和中煙100;氮素水平為低氮處理，對照處理和高氮處理，對應(yīng)的營養(yǎng)液氮濃度分別為0.2、2、20 mmol/L。待煙苗長至4葉1心時移至營養(yǎng)液培養(yǎng)。每個處理3次重復(fù)。完全營養(yǎng)液的組成及濃度為：2.5 mmol/L KCl，2 mmol/L MgSO₄，1 mmol/L KH₂PO₄，0.01 mmol/L H₃BO₃，1 μmol/L MnSO₄，0.25 mmol/L CuSO₄，1 μmol/L?ZnSO₄，0.25 mmol/L （NH₄）₆Mo₇O₂₄，0.2 mmol/L Fe-EDTA，0.2 mmol/L FeSO₄。對煙苗移栽后第1片新葉掛牌，取下一片新展開葉，使用手機(jī)拍照并測定葉綠素含量。

田間試驗(yàn)于2019年3月至6月在江西省安?？h進(jìn)行，為品種和氮肥用量雙因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，烤煙品種為K326與中煙100。氮肥用量分別為0、90、180 kg/hm²。每個處理3次重復(fù)。移栽后47 d，取各品種各處理上部完全展開新葉，使用手機(jī)拍照并測定葉綠素含量。

1.2 ?測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 ?葉綠素含量的測定?參考蘇永士等^[10]的方法進(jìn)行。

1.2.2 ?葉片數(shù)字圖像的獲取與處理 ?營養(yǎng)液試驗(yàn)及田間試驗(yàn)，取無損的葉片作為待測樣品，無風(fēng)無云的晴天12：00—14：00于室外使用蘋果智能手機(jī)（iphone?XS max）原生相機(jī)對葉片拍照，拍照距離固定1?m，角度90°，曝光與白平衡均為自動模式，圖片以JPG格式存儲，圖像分辨率4032*3024像素。獲得的照片導(dǎo)入計算機(jī)后用Photoshop?14.0軟件將葉片圖像進(jìn)行分割，去除背景，僅保留葉片主體部分（不含葉脈），用Photoshop?14.0的直方圖程序獲取圖像顏色參數(shù)紅光值R（redness intensity）、綠光值G（greenness intensity）和藍(lán)光值B（blueness intensity）。

1.2.3 ?顏色指標(biāo)的獲取??根據(jù)前人研究結(jié)果^[7]，選取了歸一化顏色指標(biāo)、比顏色指標(biāo)和歸一化差分顏色指標(biāo)3類顏色指標(biāo)類型，其中歸一化顏色指標(biāo)包括NRI=R/（R+G+B）^[11-13]，NGI=G/（R+G+B）^[14-15]，NBI=B/（R+G+B）^[16];比顏色指標(biāo)包括R/（G+B）^[17]，G/（R+B）^[17]，B/（R+G）^[17]，（R-B）/G^[17-18]，（G-B）/R^[17-18];歸一化差分顏色指標(biāo)包括（G-R）/（R+G+B）^[19]，（R-B）/（R+G+B）^[17，20]，（G-B）/（R+G+B）^[21]，ExR=（1.4R-G）/（R+G+B）^[19]，（1.4B-G）/（R+G+B）^[19]，（2G-R-B）/（R+G+B）^[19]。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析方法

1.3.1 ?氮素營養(yǎng)診斷方程模型驗(yàn)證方法??通過對葉綠素指標(biāo)的測定和顏色參數(shù)的提取，建立顏色指標(biāo)與葉綠素指標(biāo)的模型，并選擇均方根誤差（Root mean square error，RMSE）評價預(yù)測值和實(shí)測值的擬合效果。均方根誤差計算公式為：

1.3.2 ?數(shù)據(jù)的處理與分析??圖像處理使用Photoshop 8.0，使用Graphpad?Prism?6、Microsoft Excel 2016 及SPSS 19進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?烤煙不同品種及不同氮素水平對葉綠素含量的影響

圖1表明，在低氮水平下葉綠素含量均較低，隨供氮水平升高，中煙100和NC55葉綠素含量隨之升高，K326和云煙87在供氮濃度達(dá)到2 mmol/L之后不再升高。說明K326和云煙87對氮素水平較為敏感，中煙100與NC55敏感性較差。Chl.a與Chl.（a+b）變化規(guī)律一致，Chl.b在不同氮素水平和品種間呈現(xiàn)的差異較小，說明氮素水平對葉綠素含量的影響主要是通過Chl.a實(shí)現(xiàn)的。綜上，不同氮素水平對葉綠素含量有顯著影響且在品種間呈現(xiàn)差異性。

2.2 ?烤煙葉片葉綠素含量及數(shù)字圖像顏色參數(shù)及其變異性

由表1可知，在不同供氮水平下，不同烤煙品種Chl.（a+b）極值相差較大，Chl.a的次之，Chl.b的相差最小。由兩試驗(yàn)的顏色特征參數(shù)可知：平均值由大到小順序?yàn)榫G光值>紅光值>藍(lán)光值，說明烤煙葉片綠光反射量最高，紅光次之，藍(lán)光最小。較視覺感官（圖2），光譜參數(shù)更加精準(zhǔn)地反映了葉色

差異。從變異系數(shù)可知：顏色指標(biāo)變異系數(shù)由大到小順序?yàn)榧t光值>綠光值>藍(lán)光值，說明在品種和氮素水平試驗(yàn)中，藍(lán)光值的穩(wěn)定性較好，屬于較穩(wěn)定的參數(shù)，而紅光值波動較大，屬于敏感參數(shù)。另外，葉綠素指標(biāo)變異系數(shù)由大到小順序?yàn)镃hl.a>Chl.（a+b）>Chl.b，其中Chl.b最為穩(wěn)定，Chl.a波動較大。兩試驗(yàn)葉綠素指標(biāo)變異系數(shù)均在20%～30%之間，樣本均為中等程度變異樣本，符合建立方程的數(shù)據(jù)樣本變異要求。

2.3 ?烤煙冠層圖像顏色指標(biāo)的篩選

由表2顏色指標(biāo)與葉綠素含量的相關(guān)性分析可知，除B/（R+G）、（G-B）/R、NBI、（G-B）/（R+G+B）、（1.4B-G）/（R+G+B）外，其他圖像顏色指標(biāo)均與各葉綠素含量有顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系。其中，G/（R+B）、NGI、（2G-R-B）/（R+G+B）與Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）在p<0.05水平顯著相關(guān)，6個指標(biāo)在p<0.01水平顯著相關(guān)，他們相關(guān)性大小為R/（G+B）>NRI>ExR> （G-R）/（R+G+B）>（R-B）/G>（R-B）/（R+G+B），除G/（R+B）、NGI、（2G-R-B）/（R+G+B）、（G-R）/（R+G+B）外，均與葉綠素基本指標(biāo)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。各顏色指標(biāo)與3個葉綠素指標(biāo)的相關(guān)性基本穩(wěn)定一致，Chl.（a+b）相關(guān)系數(shù)均高于Chl.a與Chl.b，與顏色指標(biāo)的相關(guān)性更好。根據(jù)與葉綠素含量的相關(guān)性大小，在3類顏色指標(biāo)中分別選取NRI、R/（G+B）、ExR作為預(yù)測葉綠素含量的潛在指標(biāo)。

2.4 ?烤煙葉綠素含量診斷方程模型檢驗(yàn)

本試驗(yàn)選擇線性方程來表示營養(yǎng)指標(biāo)與葉綠素含量之間的關(guān)系。驗(yàn)證結(jié)果表明，基于顏色指標(biāo)NRI、R/（G+B）建立的診斷方程模型，葉綠素含量的真實(shí)檢測值與方程模型預(yù)測值均較為吻合，真實(shí)檢測值分布集中，模型驗(yàn)證精度較高（圖3）。經(jīng)計算NRI、R/（G+B）、ExR與Chl.a的RMSE值分別為0.6069、0.6053、0.8778，NRI、R/（G+B）、ExR與Chl.b的RMSE值分別為0.1567、0.1566、0.2033，

NRI、R/（G+B）、ExR與Chl.（a+b）的RMSE值分別為0.7575、0.7552、1.0749。RMSE反映了預(yù)測數(shù)據(jù)偏離真實(shí)值的程度，值越小，表示該模型預(yù)測精度越高。3個顏色指標(biāo)，NRI、R/（G+B）的RMSE明顯優(yōu)于ExR，預(yù)測精度最高。R/（G+B）的相對預(yù)測效果略優(yōu)于NRI，用R/（G+B）值分別表示Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）的直線預(yù)測方程分別為y=-22.916x+14.353，y=-4.6338x+3.1192，y=-27.549x+17.473。

3 ?討 ?論

營養(yǎng)液試驗(yàn)中，3個顏色參數(shù)與葉綠素含量顯著相關(guān)，6個顏色參數(shù)與葉綠素含量極顯著相關(guān)，其中比顏色指標(biāo)中的R/（G+B）的相關(guān)系數(shù)最高，為0.632;研究表明^[22]，顏色指標(biāo)與葉綠素含量相關(guān)性在0.7左右為最優(yōu)，說明本研究中通過營養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的可見光譜葉綠素含量估測模型具有可行性。與多數(shù)研究者不同^[22-25]，本研究中運(yùn)用與營養(yǎng)液試驗(yàn)環(huán)境完全不同的田間試驗(yàn)來驗(yàn)證葉綠素估算模型，通過相關(guān)性分析表明，3個顏色指標(biāo)NRI、R/（G+B）、ExR的RMSE較小，符合反演要求。其中以顏色指標(biāo)R/（G+B）為最佳。其他研究也表明，R/（G+B）參數(shù)建立的錦橙葉片SPAD值預(yù)測模型誤差最小^[24]，棉花葉片的Chl.a、Chl.b、Chl（a+b）與R/（G+B）也呈極顯著相關(guān)關(guān)系^[25]。

圖像獲取需要一定的標(biāo)準(zhǔn)和方法，研究表明^[26]，圖片的拍攝角度、拍攝高度、圖片儲存格式對光譜參數(shù)沒有影響，但不同光照強(qiáng)度和不同圖像分辨率對圖片的光譜參數(shù)值影響較大。本研究拍攝環(huán)境條件下，圖片陰影面積較小，對圖片處理結(jié)果影響較小。在拍攝設(shè)備的選擇上，選擇分辨率較高，統(tǒng)計像素點(diǎn)小而準(zhǔn)確的高像素設(shè)備拍攝，有效降低分辨率帶來的試驗(yàn)誤差。圖3結(jié)果中顏色指標(biāo)RMSE值較小，精度符合要求，說明模型可以兼容自動白平衡模式下的色溫誤差。這可能由于顏色參數(shù)的比值組合消除了不同環(huán)境下色溫差異對試驗(yàn)結(jié)果的影響，大大降低了該方法在實(shí)際田間應(yīng)用中的操作難度。

利用光譜技術(shù)檢測作物的營養(yǎng)狀況，符合現(xiàn)代

精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)的要求，有利于改變傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測葉綠素的方式，縮短檢測周期和降低操作難度。但研究取樣時期選擇為苗期，預(yù)測模型在不同生育時期是否適用及如何快速準(zhǔn)確地獲得葉片顏色指標(biāo)還需開展進(jìn)一步的研究。構(gòu)建的葉綠素含量估算模型，為直接在冠層尺度上應(yīng)用可見光譜技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)，未來可將試驗(yàn)結(jié)果與高空和低空遙感相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)烤煙更高尺度和區(qū)域的葉綠素含量檢測。另一方面還要繼續(xù)挖掘葉綠素含量對光譜響應(yīng)的影響，進(jìn)一步揭示葉片光譜反射率響應(yīng)的機(jī)理。

4??結(jié) ?論

通過營養(yǎng)液試驗(yàn)建立的煙葉顏色指標(biāo)與葉綠素的關(guān)系模型在田間試驗(yàn)中得到檢驗(yàn)。煙葉葉綠素含量估測的最佳顏色指標(biāo)為R/（G+B）;Chl.a、Chl.b、Chl.（a+b）的最佳預(yù)測方程分別為y=-22.916x+14.353、y=-4.6338x+3.1192、y=-27.549x+17.473。利用數(shù)碼相機(jī)對煙草葉綠素含量進(jìn)行快速測定，可實(shí)現(xiàn)及時指導(dǎo)煙田施肥。葉綠素含量預(yù)測模型在煙草不同生育時期是否適用及如何快速準(zhǔn)確獲得葉片顏色指標(biāo)還需開展進(jìn)一步的研究。

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