劉向麗，李僉*，田晶*，費旭，曾超，張楠，王勛

1(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034) 2(大連工業(yè)大學(xué) 分析測試中心，遼寧 大連，116034)

柑橘加工過程中會產(chǎn)生近40%的果皮、果渣等廢棄物，除小部分用于動物飼料和果膠等的制備外[1-2]，大部分被丟棄，造成資源浪費和環(huán)境污染，因此提高柑橘加工廢棄物的資源化利用水平具有重要的研究意義。王聳等[3]以柑橘加工副產(chǎn)物——柚皮為原料，對棘孢曲霉固態(tài)發(fā)酵柚苷酶的工藝進(jìn)行研究，柚苷酶發(fā)酵酶活力達(dá)到8.19 IU/g干物質(zhì)，比初始培養(yǎng)基產(chǎn)柚苷酶活力提高7.38 倍，表明可以利用柑橘加工廢棄物為底物發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶；而楊穎等[4]采用橘渣水復(fù)配培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose, BC)，產(chǎn)量可達(dá)10.26 g/L，是不添加橘渣水培養(yǎng)基的2.27 倍，表明利用果渣進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵具有可行性，并能有效提高產(chǎn)量。將柑橘果渣應(yīng)用到發(fā)酵工藝中是有效降低柚苷酶生產(chǎn)成本的潛在途徑之一，并且對環(huán)境保護(hù)和資源高效利用具有積極作用。

柚苷酶(naringinase)是一種由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)組成的復(fù)合酶[5]，在柑橘類果汁的加工脫苦[6-7]、物質(zhì)的分離制備、鼠李糖的工業(yè)制備、黃酮類物質(zhì)的工業(yè)制備、抗生素的生產(chǎn)等方面具有重要的應(yīng)用價值。游離狀態(tài)的柚苷酶在使用過程中存在操作穩(wěn)定性差、分離和回收困難等問題[8]，而固定化柚苷酶在應(yīng)用中可以有效解決上述問題[9]。固定化酶的制備方法主要包括載體固定化法和無載體固定化法，其中無載體固定化法如交聯(lián)酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)技術(shù)，不需要提供任何載體，且具有催化效率高、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點[10]，是一種具有潛在應(yīng)用和開發(fā)價值的無載體固定化酶技術(shù)。武仙山等[11]對交聯(lián)酶聚集體技術(shù)進(jìn)行了綜述，就CLEAs的制備、在水溶液中的活性和穩(wěn)定性、在有機(jī)溶劑中的活性和作用機(jī)理等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示其活性和穩(wěn)定性可與交聯(lián)酶晶體技術(shù)相媲美，且操作簡便，更利于研究和應(yīng)用的普及。

本研究以柑橘果渣浸出液為培養(yǎng)基基質(zhì)，對實驗室自主保藏的菌種黑曲霉FFCC uv-11進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶研究，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成提高柚苷酶發(fā)酵酶活，進(jìn)一步制備出交聯(lián)柚苷酶聚集體，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究。本研究為柑橘水果資源的深度開發(fā)提供了一種有效方式，以達(dá)到環(huán)境保護(hù)和資源高效利用的目的，并可進(jìn)一步用于研究微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過程，為生物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株：黑曲霉FFCC uv-11，實驗室自主保藏。

材料：蜜橘，產(chǎn)自江西新余；柚皮苷(≥98%)，寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；脫脂豆粉、麩皮粉，大連調(diào)味食品廠。其他化學(xué)試劑皆為分析純。

儀器設(shè)備：PHS-3C pH計，上海比朗儀器制造公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)，上海儀電科學(xué)儀器股份公司；Spectrum 10傅里葉紅外光譜儀，美國PerkinElmer；JSM 7800F掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices(MD)公司。

斜面培養(yǎng)基(g/L)[12]：NaNO33.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，K2HPO4·12H2O 1.0，KH2PO4·2H2O 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，蔗糖30.0，瓊脂30.0，柚皮苷2.0，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[12]：KH2PO4·2H2O 1.5，K2HPO4·12H2O 1.5，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO44.0，ZnSO4·7H2O 0.09，CaCl20.1，酵母浸粉2.0，柚皮苷1.5，初始pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 單孢子懸液的制備[12]

將黑曲霉菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d得到成熟的孢子，然后用9 g/L無菌生理鹽水沖洗孢子，倒入裝有玻璃珠和無菌生理鹽水的錐形瓶中，搖勻充分打散孢子，測定孢子懸液的OD600值，并用無菌生理鹽水將其調(diào)整至OD600為0.18，即得單孢子懸液，備用。

1.2.2 果渣浸出液的制備

將蜜橘榨汁處理后產(chǎn)生的果渣與去離子水以適當(dāng)比例混合后在50 ℃水浴中處理2 h，經(jīng)紗布過濾后得到濾液，即為果渣浸出液，備用。

1.2.3 發(fā)酵液的制備

將孢子懸液以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種至裝液量為30 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)中，在30 ℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.4 交聯(lián)柚苷酶聚集體的制備[13]

取10 mL 柚苷酶發(fā)酵液于試管中，加入2.0 倍體積的叔丁醇溶液，置于4 ℃冰箱中沉淀30 min，接著向試管中加入體積分?jǐn)?shù)為2.0%的戊二醛溶液，混勻后置于4 ℃冰箱中進(jìn)行交聯(lián)處理1.5 h。將反應(yīng)液在4 000 r/min 條件下離心10 min，移去上清液，并用10 mmol/L pH 4.0 的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液溶液清洗3 遍，最終得到的沉淀物即為交聯(lián)柚苷酶聚集體，保存于4 ℃冰箱中,備用。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

每組實驗均設(shè)置3個平行并重復(fù)3次，利用Origin 8.5 科學(xué)繪圖軟件進(jìn)行分析和處理。

1.3 測定方法

1.3.1 柚苷酶活性的測定

采用改進(jìn)的DAVIS法[14]：將0.8 mL的0.8 mg/mL柚皮苷溶液與0.2 mL粗酶液混合均勻，置于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min。取0.1 mL反應(yīng)液，加入5 mL一縮二乙二醇(φ=90%)和0.1 mL的NaOH溶液(4 mol/L)，在室溫下靜置10 min，于波長420 nm處測定溶液的吸光值。

柚苷酶活力單位定義[15]：在pH 4.5，溫度為50 ℃的條件下，1 min水解1 μg的柚皮苷所需的酶量為1個酶活性單位(U/mL或U/g)。

(1)

酶活回收率/%=

(2)

1.3.2 交聯(lián)柚苷酶聚集體的表征

分別用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)和紅外光譜(fourier transform infrared, FTIR)對交聯(lián)柚苷酶聚集體進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 渣水比對柚苷酶發(fā)酵酶活的影響

由圖1可知，隨著果渣浸出液制備過程中渣水比的提高，柚苷酶的發(fā)酵酶活先逐漸增加，在果渣與水比例為1∶8時，柚苷酶酶活達(dá)到最大值為430.19 U/mL，是未添加果渣進(jìn)行發(fā)酵時柚苷酶酶活(77.21 U/mL)的5.57倍。而進(jìn)一步提高渣水比，柚苷酶酶活迅速下降，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相一致。果渣浸出液太濃或太稀均不利于柚苷酶的生產(chǎn)[4]，其原因可能是果渣浸出液濃度太低(即渣水比較高)時，所含營養(yǎng)物質(zhì)[16]如糖類、氨基酸、微量元素，特別是黃酮類生物活性物質(zhì)的濃度過低，對菌株生長的促進(jìn)作用不明顯，進(jìn)而導(dǎo)致柚苷酶發(fā)酵酶活較低；而當(dāng)果渣浸出液濃度較高(即渣水比較低)時，其中含有抑制黑曲霉uv-11菌株生長或者不利于柚苷酶積累的物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)柑橘廢棄物中所含的油脂對酵母和霉菌(例如枯草芽孢桿菌，釀酒酵母，曲霉菌)的生長具有抑制作用[17]，因此選擇合適的渣水比制備果汁浸出液能夠有效提高柚苷酶發(fā)酵酶活。

圖1 渣水比對柚苷酶發(fā)酵酶活的影響

2.2 果渣浸出液發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶的工藝研究

2.2.1 碳源種類對柚苷酶發(fā)酵酶活的影響

將黑曲霉FFCC uv-11在以果渣浸出液為基質(zhì)的培養(yǎng)基上發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶，研究不同碳源對柚苷酶發(fā)酵酶活的影響，實驗結(jié)果如圖2所示，以麩皮粉為碳源時，柚苷酶發(fā)酵酶活最高，可達(dá)650.37 U/mL，而以可溶性淀粉為碳源時，柚苷酶發(fā)酵酶活最低(109.34 U/mL)。麩皮對菌種產(chǎn)酶的影響主要從2方面考慮[18]：一方面是其為產(chǎn)酶提供必要的營養(yǎng)因子；另一方面，其含量增加又會降低培養(yǎng)基的蓬松程度，使通氣量降低，從而影響產(chǎn)酶。且麩皮粉價格便宜，來源廣泛，是柚苷酶發(fā)酵的優(yōu)良碳源。

圖2 碳源種類對柚苷酶發(fā)酵酶活的影響

2.2.2 麩皮粉質(zhì)量濃度對柚苷酶發(fā)酵酶活的影響

由圖3可知，當(dāng)麩皮粉質(zhì)量濃度在1.5～5.5 g/L范圍內(nèi)時，隨著麩皮粉濃度的增大，柚苷酶發(fā)酵酶活力逐漸提高，當(dāng)麩皮粉質(zhì)量濃度為5.5 g/L時，柚苷酶酶發(fā)酵酶活達(dá)到最高，為892.96 U/mL；而麩皮粉質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時，柚苷酶酶發(fā)酵酶活逐漸降低。伍玉春等[19]利用黑曲霉SL2K發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)麩皮粉添加量在1%～3%時，隨著麩皮粉添加量的增加，所產(chǎn)柚苷酶酶活力逐漸提高，而當(dāng)麩皮粉添加量>3%時，柚苷酶酶活力逐漸降低。因此，本實驗確定較優(yōu)的麩皮粉質(zhì)量濃度為5.5 g/L。

圖3 麩皮粉質(zhì)量濃度對柚苷酶發(fā)酵酶活力的影響

2.2.3 氮源種類對柚苷酶發(fā)酵酶活力的影響

微生物對不同氮源的利用能力不同，而不同種類的氮源對促進(jìn)微生物生長和產(chǎn)酶的作用也不同，因此發(fā)酵過程中應(yīng)選出合適的氮源種類，防止不適宜的氮源對菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酶造成不利的影響[20]。由圖4可知，(NH4)2SO4更利于菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，此時柚苷酶發(fā)酵酶活力(821.56 U/mL)達(dá)到最高，而有機(jī)氮源中加入酵母浸粉后柚苷酶發(fā)酵酶活(641.52 U/mL)較高，與文獻(xiàn)報道一致。劉艷苓等[21]通過不同氮源的比較，最終選定酵母浸膏作為氮源,用于棘孢曲霉JMUdb058發(fā)酵產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶，使鼠李糖苷酶發(fā)酵酶活比初始培養(yǎng)基的酶活提高了84.67%。

圖4 氮源種類對柚苷酶發(fā)酵酶活的影響

2.2.4 不同質(zhì)量比復(fù)合氮源對柚苷酶發(fā)酵酶活力的影響

無機(jī)氮源成分單一、質(zhì)量穩(wěn)定、可被菌體快速利用，而有機(jī)氮源中含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類、游離的氨基酸以及少量的生長因子、糖類和脂肪等，使得微生物表現(xiàn)出生長旺盛、菌體濃度增長迅速等特點。因此，文獻(xiàn)也多采用無機(jī)氮源和有機(jī)氮源復(fù)配的方式[20, 22]。由圖5可知，當(dāng)(NH4)2SO4與酵母浸粉質(zhì)量比為7∶3時，柚苷酶發(fā)酵酶活(1 180.15 U/mL)達(dá)到最高，顯著高于單一無機(jī)氮源(NH4)2SO4或單一有機(jī)氮源酵母浸粉進(jìn)行發(fā)酵時的柚苷酶發(fā)酵酶活力。如陳娜等[23]采用(NH4)2SO4與酵母浸粉作為氮源用于黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，其發(fā)酵酶活力較優(yōu)化前提高了39.30%。

A-(NH4)2SO4;Y-酵母浸粉

利用果渣浸出液發(fā)酵黑曲霉得到的柚苷酶發(fā)酵酶活力高達(dá)1 180.15 U/mL，是初始條件下柚苷酶發(fā)酵酶活力的16.3倍。廉萌等[12]采用黑曲霉FFCC uv-11與根霉FFCC 3201共培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶，經(jīng)優(yōu)化后柚苷酶發(fā)酵酶活力可達(dá)733.19 U/mL，是未優(yōu)化的2.22倍；袁文博等[24]通過誘變處理獲得1株高產(chǎn)柚苷酶菌株A.alternateSK.37002，進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化后柚苷酶發(fā)酵酶活力達(dá)到624.73 U/mL，發(fā)酵酶活力比優(yōu)化前提高了90%。為提高柚苷酶發(fā)酵酶活力和探索柚苷酶發(fā)酵生產(chǎn)新工藝提供了思路。

2.3 交聯(lián)柚苷酶聚集體的制備及酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 交聯(lián)柚苷酶聚集體的制備

為了提高柚苷酶的操作穩(wěn)定性、簡化分離和回收工藝，進(jìn)一步將發(fā)酵所得柚苷酶制備成無載體固定化酶——交聯(lián)酶聚集體，研究了不同種類沉淀劑、沉淀劑與發(fā)酵液體積比、交聯(lián)劑濃度和交聯(lián)時間對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備過程的影響。結(jié)果表明，以叔丁醇為沉淀劑，加入體積為2.0倍發(fā)酵液體積的叔丁醇對柚苷酶分子進(jìn)行沉降聚集，然后加入體積分?jǐn)?shù)為2.0% 的戊二醛作為雙功能交聯(lián)劑，在4 ℃條件下交聯(lián)1.5 h，制備得到交聯(lián)柚苷酶聚集體的酶活可達(dá)505.21 U/mL，酶活回收率可達(dá)73%以上。

2.3.2 交聯(lián)柚苷酶聚集體的SEM表征

由圖6交聯(lián)柚苷酶聚集體的電鏡掃描結(jié)果可知，其表面疏水性高，糖基化程度低，結(jié)構(gòu)致密，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子間相互接連，孔徑分布均勻，利于酶分子與相應(yīng)底物結(jié)合，從而推測酶活性表現(xiàn)良好，增加了與酶分子反應(yīng)的有效面積，提高了酶的利用效率，相比較游離酶而言其溫度酸堿穩(wěn)定性隨交聯(lián)反應(yīng)而提高。

圖6 交聯(lián)柚苷酶聚集體電鏡照片

2.3.3 交聯(lián)柚苷酶聚集體的紅外表征

2.3.4 交聯(lián)柚苷酶聚集體的酶學(xué)性質(zhì)探究

交聯(lián)柚苷酶聚集體與游離柚苷酶水解柚皮苷實驗的最佳反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性的實驗結(jié)果如圖8所示。由圖8-a可知，交聯(lián)柚苷酶聚集體的最佳反應(yīng)pH與游離柚苷酶的最佳反應(yīng)pH一致，且在相同pH下交聯(lián)柚苷酶聚集體相對酶活力更高。而圖8-b表明，游離柚苷酶的相對酶活力隨pH的增加迅速降低，而交聯(lián)柚苷酶聚集體的相對酶活力在pH 2.5～8.5范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，均在85%以上。與朱必玉[13]制備的交聯(lián)柚苷酶聚集體相比，本研究的交聯(lián)柚苷酶聚集體在pH 3.5～5.5即最佳水解反應(yīng)條件時，相對酶活力可達(dá)99%以上，而在堿性條件下即pH 7.5～8.5時,相對酶活力仍能達(dá)到85%左右，比朱必玉[13]的結(jié)果提高3倍以上，說明其具有較強(qiáng)的pH 穩(wěn)定性。

圖7 游離柚苷酶和交聯(lián)柚苷酶聚集體紅外光譜圖

a-酶解柚皮苷反應(yīng)的最適反應(yīng)pH;b-酶解柚皮苷反應(yīng)的pH穩(wěn)定性

交聯(lián)柚苷酶聚集體與游離柚苷酶水解柚皮苷實驗的最佳反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性的實驗結(jié)果如圖9所示。由圖9-a可知，交聯(lián)柚苷酶聚集體的最佳反應(yīng)溫度與游離柚苷酶的最佳反應(yīng)溫度一致，在相同反應(yīng)溫度下交聯(lián)柚苷酶聚集體的相對酶活力更高，這與徐杰等[15]的研究結(jié)果一致，并在一定程度上表明交聯(lián)柚苷酶聚集體具有優(yōu)良的溫度穩(wěn)定性。如圖9-b所示，分別在40～70 ℃保藏6 h后，游離柚苷酶酶活力迅速下降，而交聯(lián)柚苷酶聚集體仍能保持較高的酶活性，這與張雙正等[26]采用羧基磁性納米粒子制備雜化磁響應(yīng)交聯(lián)酶聚集體(M-CLEAs)的實驗規(guī)律相同。同時，與游離柚苷酶相比，交聯(lián)柚苷酶聚集體在 50～70 ℃的熱穩(wěn)定性均有大幅度提高，這主要是由于酶分子發(fā)生交聯(lián)之后，分子之間連接更緊密，酶失活需要克服更多的非共價及共價作用力，同時酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動減小，其發(fā)生熱伸展變性的可能性變小，因而提高了其在高溫條件下的穩(wěn)定性[27]。

a-酶解柚皮苷反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度;b-酶解柚皮苷反應(yīng)的溫度穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本研究利用柑橘果渣浸出液為培養(yǎng)基基質(zhì)，對實驗室自主保藏的菌種黑曲霉FFCC uv-11進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶研究，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成提高柚苷酶發(fā)酵酶活，進(jìn)一步制備出無載體固定化酶——交聯(lián)柚苷酶聚集體，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究。結(jié)果表明，當(dāng)果渣與水的比例為1∶8、以5.5 g/L麩皮粉為碳源、(NH4)2SO4與酵母浸粉(質(zhì)量比為7∶3)為氮源時，柚苷酶發(fā)酵酶活可達(dá)1 180.15 U/mL，是未優(yōu)化條件下柚苷酶發(fā)酵酶活的15.3倍。進(jìn)一步以叔丁醇為沉淀劑，戊二醛(φ=2.0%)為雙功能交聯(lián)劑，在4 ℃條件下交聯(lián)1.5 h，所得交聯(lián)柚苷酶聚集體的酶活回收率可達(dá)73%以上，且具有良好的pH和溫度穩(wěn)定性。