潘孝青 王杏龍 楊杰 秦楓 邵樂(lè) 李健 張霞 翟頻

摘要：為探討不同LED光色影響母兔繁殖效率的分子機(jī)制，將單籠飼養(yǎng)的300只后備母兔隨機(jī)分成5組進(jìn)行不同LED光色處理，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。在4個(gè)不同LED光色處理組兔籠上方60 cm處向下分別投射LED紅光（660 nm）、LED綠光（540 nm）、LED藍(lán)光（480 nm）和LED白光（400～760 nm），對(duì)照組投射白熾燈光（400～1 050 nm）。母兔每周接受3次補(bǔ)光（LED光處理），即每周的周五至周日下午18∶00至次日上午6∶00，時(shí)長(zhǎng)為12 h，預(yù)試驗(yàn)7 d，正試期90 d。LED燈及白熾燈的光照度均設(shè)置為100 lx。結(jié)果顯示：LED紅光組母兔同期發(fā)情率與白熾燈光對(duì)照組及LED白光組相比，分別提高20.89個(gè)百分點(diǎn)和10.51個(gè)百分點(diǎn)，差異顯著（P<0.05）;與綠光組及藍(lán)光組相比，分別提高4.66個(gè)百分點(diǎn)和7.33個(gè)百分點(diǎn)，差異不顯著（P>0.05）。LED紅光組母兔卵巢紅色大卵泡數(shù)量有增加趨勢(shì)，但各試驗(yàn)組間卵巢紅色大卵泡數(shù)量差異不顯著（P>0.05）。與白熾燈光、LED白光、綠光、藍(lán)光相比，LED紅光能促進(jìn)母兔垂體GnRHR mRNA表達(dá)，但差異不顯著（P>0.05）;與LED白光、綠光、藍(lán)光相比，LED紅光顯著提高了卵巢組織中FSHR、LHR 基因mRNA的表達(dá)（P<0.05）;與白熾燈光對(duì)照相比，LED紅光有提高卵巢組織中FSHR、LHR 基因mRNA表達(dá)水平的趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）。在原始卵泡（PrF）階段與初級(jí)卵泡（PF）階段，不同LED光色處理的卵泡數(shù)量差異不顯著（P>0.05）;與原始卵泡（PrF）及初級(jí)卵泡（PF）相比，由于卵泡逐級(jí)閉鎖，次級(jí)卵泡（SF）數(shù)量顯著降低，不同組間開(kāi)始出現(xiàn)差異，與LED綠光組及LED藍(lán)光組相比，LED紅光組、LED白光組及白熾燈光對(duì)照組次級(jí)卵泡（SF）數(shù)量顯著增加（P<0.05）;由于卵泡進(jìn)一步閉鎖，與原始卵泡（PrF）、初級(jí)卵泡（PF）以及次級(jí)卵泡（SF）相比，三級(jí)卵泡（TF）數(shù)量顯著減少，不同組間三級(jí)卵泡（TF）數(shù)量也呈現(xiàn)不同差異，與LED綠光組、LED藍(lán)光組及白熾燈光對(duì)照組相比，LED紅光組三級(jí)卵泡（TF）數(shù)量顯著增加（P<0.05），但與LED白光組相比，差異不顯著（P>0.05）。與LED綠光相比，LED紅光及白熾燈光能顯著抑制母兔卵巢FoxO1 mRNA表達(dá)（P<0.05）;與LED白光及LED藍(lán)光相比，LED紅光及白熾燈光有抑制母兔卵巢FoxO1 mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）。Bcl-2/Bax mRNA兩個(gè)凋亡相關(guān)基因在兔卵巢中均有表達(dá)，但兩者的相對(duì)表達(dá)量顯著差異（P<0.05），Bax mRNA表達(dá)量顯著高于Bcl-2 mRNA表達(dá)量;不同LED光色對(duì)兔卵巢Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的影響也存在差異，與LED綠光、藍(lán)光及白熾燈光相比，LED紅光顯著提高Bcl-2 mRNA的表達(dá)量（P<0.05），但與LED白光相比差異不顯著（P>0.05），Bcl-2基因表達(dá)量受到不同光色的影響呈現(xiàn)紅光>白光>白熾燈光>綠光>藍(lán)光;不同LED光色對(duì)Bax mRNA表達(dá)的影響呈現(xiàn)綠光>藍(lán)光>白光>白熾燈光>紅光，但各組間差異不顯著（P>0.05）。總之，規(guī)模兔場(chǎng)短日照季節(jié)周期化繁殖生產(chǎn)中，每周連續(xù)3 d于晚間18∶00至次日凌晨6∶00之間，采用100 lx的LED紅光進(jìn)行補(bǔ)光，可提高母兔同期發(fā)情率;HPG軸上繁殖調(diào)控關(guān)鍵受體基因轉(zhuǎn)錄水平、卵巢次級(jí)卵泡和三級(jí)卵泡數(shù)量以及與卵泡閉鎖和氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平均受到LED不同光色的影響。

關(guān)鍵詞：LED光;兔;繁殖性能;分子調(diào)控

中圖分類號(hào)：S829.14+6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）01-0136-11

Abstract：To explore the molecular mechanism of different LED light colors affecting the reproductive efficiency of female rabbits， three hundred female rabbits reared in a single cage were randomly divided into five groups for different LED light colors treatments. LED red light （660 nm）， LED green light （540 nm）， LED blue light （480 nm） and LED white light （400-760 nm） were projected downwards at 60 cm above the rabbit cage. The control group was incandescent lamp （400-1 050 nm）. Female rabbits received the treatment with supplementary light three times a week， the duration was 12 hours （12D∶12L）， the pre-experiment was seven days， and the standard test was 90 days. The light intensity of LED lamp and incandescent lamp was set as 100 lx. Compared with incandescent lamp group and LED white light group， the estrus rate of female rabbits in LED red light group increased by 20.89 percentage points and 10.51 percentage points（P<0.05）. Compared with LED green light group and LED blue light group， the estrus rate of female rabbits in LED red light group increased by 4.66 percentage points and 7.33 percentage points（P>0.05）. The number of large red follicles in the ovaries of the female rabbits in the LED red light group increased， but there was no significant difference between the experimental groups （P>0.05）. Compared with incondescent light， LED white light， LED green light and LED blue light， LED red light could promote the mRNA expression of GnRHR in the pituitary gland of female rabbits， but the difference was not significant （P>0.05）. Compared with LED white light， LED green light and LED blue light， LED red light significantly increased the expression of FSHR and LHR in ovarian tissue （P<0.05）. Compared with the incandescent light， LED red light could increase mRNA expression of FSHR and LHR gene in ovarian tissue， but the difference was not significant （P>0.05）. In the primordial follicles （PrF） stage and the primary follicles （PF） stage， the effect of different LED light colors on the number of follicles was not significant（P>0.05）. Compared with PrF and PF， the number of secondary follicles （SF） was significantly reduced due to the stepwise blocking of follicles， and differences began to appear between different groups. Compared with that in LED green light group and the LED blue light group， the number of SF in LED red light group， LED white light group and incandescent light group increased significantly （P<0.05）. Due to further atresia of follicles， the number of tertiary follicles （TF） decreased significantly. Compared with that in the LED green light group， LED blue light group and incandescent light group， the number of TF in the LED red light group was significantly increased （P<0.05）， but there was no significant difference in the number of TF between the LED red light group and the LED white light group（P>0.05）. Compared with the LED green light， LED red light and incandescent light could significantly inhibit mRNA expression of FoxO1 in female rabbit ovaries （P<0.05）. Compared with LED white light and LED blue light， LED red light and incandescent light could inhibit mRNA expression of FoxO1 in female rabbit ovary， but the difference was not significant （P>0.05）. Both apoptosis-related genes of Bcl-2/Bax mRNA were expressed in rabbit ovary， but the relative expression levels of them were significantly different （P<0.05）. The expression level of Bax mRNA was significantly higher than that of Bcl-2 mRNA. The effects of different LED light colors on Bcl-2/Bax mRNA expression in rabbit ovaries were also different. Compared with the LED green light， LED blue light and incandescent light， LED red light significantly increased the expression of Bcl-2 mRNA （P<0.05）， but there was no significant difference in the expression of Bcl-2 mRNA between the LED red light group and LED white light group（P>0.05）. The expression of Bcl-2 gene was affected by different light colors， showing a trend of red light> white light> incandescent light> green light> blue light. The effect of LED light color on Bax mRNA expression showed a trend of green light> blue light> white light> incandescent light> red light， but there was no significant difference （P>0.05）. In conclusion， during the periodical breeding and production of large-scale rabbit farms in short-day season， the estrus rate of female rabbits can be improved by using 100 lx LED red light to supplement light from 18∶00 in the evening to 6∶00 in the morning of the next day for three days in a week. The transcription levels of key receptor genes on the HPG axis for regulation of reproduction， the number of secondary follicles， the number of tertiary follicles， and the transcription levels of genes related to follicular atresia and oxidative stress were affected by different LED light colors.

Key words：LED light color;rabbit;reproductive performance;molecular regulation

母兔周期化繁殖效率是規(guī)模兔場(chǎng)生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)，生產(chǎn)中常采用外源性激素如孕馬血清促性腺激素（PMSG）、促卵泡素（FSH）調(diào)整母兔生理周期，以實(shí)現(xiàn)同期發(fā)情，提高周期化繁殖效率。但生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)母兔群體進(jìn)行同期發(fā)情處理時(shí)存在激素耐受現(xiàn)象，母兔常出現(xiàn)對(duì)性激素響應(yīng)的同期發(fā)情效果差異大、整齊度差、長(zhǎng)期使用后群體受孕率低的現(xiàn)象。其原因?yàn)镻MSG是一種大分子量抗原，長(zhǎng)期使用后母兔血清中PMSG抗體滴度增加，再次使用PMSG時(shí)極易發(fā)生抗原-抗體中和反應(yīng)，以致PMSG效價(jià)降低，效果不顯著[1]。目前規(guī)?；脠?chǎng)已普遍采用周期化生產(chǎn)模式，但母兔在短日照季節(jié)發(fā)情及配種效率低下，季節(jié)性乏情現(xiàn)象明顯，目前只能依靠人工激素維持周期化生產(chǎn)。如能采用人工光照誘導(dǎo)干預(yù)兔自身繁殖節(jié)律，則可實(shí)現(xiàn)無(wú)人工激素的周期化繁殖模式，顯著降低人工輔助配種的勞動(dòng)強(qiáng)度和經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)，與采用激素調(diào)控母兔同期發(fā)情相比，光照調(diào)控可避免母兔激素耐受效應(yīng)，提高母兔利用效率。本研究從分子水平闡述單色光調(diào)控兔性腺激素節(jié)律性分泌的分子機(jī)制，為提高規(guī)模兔場(chǎng)周期化繁殖效率以及規(guī)模兔場(chǎng)周期化生產(chǎn)中光需求參數(shù)的設(shè)定提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)時(shí)間試驗(yàn)?zāi)竿眠x自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地試驗(yàn)兔場(chǎng)（實(shí)驗(yàn)兔生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0008）。選擇體質(zhì)量接近的300只未配種純種新西蘭后備母兔，隨機(jī)平均分成5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。5組分別為白熾燈對(duì)照組、白光組、紅光組、綠光組、藍(lán)光組。選擇秋季日照時(shí)長(zhǎng)變短后開(kāi)始正式試驗(yàn)，通過(guò)每周進(jìn)行3次補(bǔ)光，觀察不同光色對(duì)母兔同期發(fā)情等繁殖性能的影響。預(yù)試驗(yàn)時(shí)間為1周（2017年9月14日-9月21日），正式試驗(yàn)時(shí)間為3個(gè)月（2017年9月22日-12月21日）。試驗(yàn)兔舍空調(diào)溫度設(shè)定為24 ℃，并通過(guò)機(jī)械通風(fēng)方式，保證空氣質(zhì)量。排除溫度、聲音、氣味刺激等干擾，確保LED光色為唯一變量。

1.1.2光照方案每個(gè)光照處理組均采用雙層遮陽(yáng)窗簾進(jìn)行分隔，單獨(dú)隔間。母兔采取不銹鋼單籠飼養(yǎng)，兔籠規(guī)格為60 cm×60 cm×60 cm。兔籠上方60 cm處分別安裝LED燈帶，向下投射LED紅光（660 nm）、LED綠光（540 nm）、LED藍(lán)光（480 nm）和LED白光（400～760 nm），對(duì)照為白熾燈光組（400～1 050 nm），每隔2 m安裝1個(gè)燈泡，安裝高度為兔籠上方2.5 m（通過(guò)Testo-540照度儀監(jiān)測(cè)，此高度下光照度與LED燈帶下的光照度一致）。正式試驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)，母兔接受LED光照的次數(shù)為每周3次，即正式試驗(yàn)中每個(gè)星期內(nèi)周五至周日下午18∶00至次日上午6∶00，時(shí)長(zhǎng)為12 h。其他時(shí)間打開(kāi)遮陽(yáng)窗簾，不進(jìn)行任何補(bǔ)光處理。LED燈帶與白熾燈采用動(dòng)態(tài)光照控制系統(tǒng)（軟著登字第1551136號(hào)）控制，光照度均設(shè)置為100 lx。光照試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，每周通過(guò)Testo-540照度儀監(jiān)測(cè)光照度，保證各組間光照度一致。光照試驗(yàn)開(kāi)始后0.5 h及燈光關(guān)閉前0.5 h，通過(guò)控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)0～100 lx和100～0 lx的光照度過(guò)渡期，以避免突然開(kāi)關(guān)燈導(dǎo)致的試驗(yàn)兔應(yīng)激。

1.1.3樣本采集正式試驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)，分別在第14 d、28 d、42 d、56 d、78 d、90 d的23∶30-24∶30進(jìn)行耳緣靜脈采血，每次每組分別選擇5只母兔（已在白天標(biāo)記發(fā)情的母兔），每只試驗(yàn)兔采集10 ml。采集的血清樣本進(jìn)行MLT濃度及情緒物質(zhì)測(cè)定。血液靜置凝固后，1 000 g離心10 min，分離血清，-20 ℃保存用于血液相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。在LED光處理后第91 d早晨，每組選擇體質(zhì)量接近、處于同一生理階段（發(fā)情中后期外陰顏色為深紅或紫紅）的5只母兔進(jìn)行屠宰。屠宰時(shí)取出母兔右側(cè)卵巢放入4%多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.4）中，固定48 h后制成常規(guī)石蠟切片進(jìn)行觀察。同時(shí)迅速取下每組母兔視網(wǎng)膜、SCN核、松果體、下丘腦、垂體、卵巢分別進(jìn)行液氮保存，以待后期試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)兔的屠宰執(zhí)行江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.1.4飼養(yǎng)管理與營(yíng)養(yǎng)水平試驗(yàn)期內(nèi)母兔均為自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理按常規(guī)進(jìn)行。水、飼料、飼養(yǎng)人員、飼養(yǎng)管理各組均一致。按照NRC兔營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配置飼料并制成全價(jià)顆粒飼料，飼料配方見(jiàn)表1。

1.2卵巢HE染色及卵泡數(shù)量統(tǒng)計(jì)

1.2.1卵巢HE染色具體方法：（1）將右側(cè)卵巢切塊，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，放入甲醛溶液中固定24 h，甲醛溶液的體積為卵巢組織塊體積的20倍。將組織塊依次放入70%、80%、95%、95%的乙醇中2 h，之后分別放入100%、100%的乙醇中1.5 h，進(jìn)行脫水處理;（2）為了使組織塊透明，將組織塊放入溶液I（二甲苯∶無(wú)水乙醇=1∶1，體積比）中30 min，之后依次放入二甲苯I和II中，每次30 min。組織塊依次放入二甲苯∶石蠟=1∶1（體積比）的混合液中30 min，之后放入石蠟I中1 h，緊接著放入石蠟II中1 h，制成蠟塊;（3）使用切片機(jī)將組織塊切成厚度為5 μm的薄片，將制備好的切片放入65 ℃的烤箱中烘烤2 h，將切片上的蠟融化;（4）將烤好的切片分別在二甲苯I中5 min、二甲苯II中5 min和二甲苯III中5 min進(jìn)行處理;（5）把切片按下面順序進(jìn)行處理：100%乙醇I中5 min，100%乙醇II中5 min，95%乙醇I中5 min， 95%乙醇II中5 min，80%乙醇中5 min，75%乙醇中5 min;（6）蘇木素染色15 min后，自來(lái)水沖洗;（7）使用鹽酸酒精（0.5%）進(jìn)行分色10 s，自來(lái)水沖洗片刻;（8）浸染伊紅（1%）3～5 min，水洗片刻;（9）把切片按下面順序進(jìn)行處理：在85%的乙醇中5 min，95%的乙醇中5 min和100%的乙醇中I和II中各5 min，最后將切片依次放入二甲苯I和II中各5 min;（10）采用中性樹(shù)膠將切片進(jìn)行封片。

1.2.2卵泡數(shù)量統(tǒng)計(jì)所用的切片為5 μm的連續(xù)切片，每間隔9張（即第10張）取1張切片統(tǒng)計(jì)卵泡的數(shù)目，每張切片對(duì)5個(gè)切面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在光鏡下面對(duì)原始、初級(jí)、次級(jí)以及有腔卵泡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。為了避免對(duì)同一卵泡的重復(fù)計(jì)數(shù)，只統(tǒng)計(jì)含有卵母細(xì)胞核的卵泡。原始卵泡的判定標(biāo)準(zhǔn)：初級(jí)卵母細(xì)胞的周圍包圍著一層扁平的上皮細(xì)胞即原始卵泡;初級(jí)卵泡的判定標(biāo)準(zhǔn)：初級(jí)卵母細(xì)胞周圍包繞著一層柱狀或立方型卵泡上皮細(xì)胞即初級(jí)卵泡;次級(jí)卵泡的判定標(biāo)準(zhǔn)：卵母細(xì)胞周圍包繞著多層卵泡上皮細(xì)胞或顆粒細(xì)胞即次級(jí)卵泡;三級(jí)卵泡的判定標(biāo)準(zhǔn)：顆粒細(xì)胞間開(kāi)始出現(xiàn)空隙，形成卵泡腔;成熟卵泡的判定標(biāo)準(zhǔn)：卵泡不斷發(fā)育，卵泡液增多，體積增大，逐漸突出于卵巢表面。

1.3基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

1.3.1Trizol 法提取組織總RNA將勻漿器、1.5 ml指形管、Trizol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品）預(yù)先置于冰上預(yù)冷，在勻漿器內(nèi)加入2 ml Trizol，將研缽和研棒用烤過(guò)的錫箔紙包好，向研缽內(nèi)加入液氮和組織樣。將研細(xì)的樣品放入勻漿器內(nèi)，冰浴中快速勻漿，勻漿液倒入2 ml指形管，置于冰上。每管加入0.4 ml氯仿，振蕩20 s，室溫放置2～3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液于另一指形管中，加入1 ml異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10min，棄掉上清液，將管倒置于紙巾上，盡量吸干其中的液體，加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、7 500 r/min離心10 min，棄掉乙醇，空氣干燥5～10 min，加50 μl DEPC處理水（或用去離子甲酰胺）溶解RNA沉淀，并將指形管置于冰上。取2 μl RNA水溶液于另一指形管中，加入98 μl DEPC處理水中，100倍稀釋，測(cè)OD260，檢測(cè)RNA濃度。用DEPC處理水溶解的RNA樣品于-70 ℃保存，用去離子甲酰胺溶解的RNA樣-20 ℃保存。

1.3.2總RNA電泳檢測(cè)電泳槽用RNA清洗液浸泡4～5 h，再用DEPC處理過(guò)的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入1×TBE待用。瓊脂糖凝膠用1×TBE配制。在10 μl上樣緩沖液中加入1 μl以上組織總RNA。65 ℃變性10 min后立即放入冰水中2～3 min，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中5 V/cm電泳，電泳至溴酚藍(lán)泳到達(dá)凝膠的2/3處，取下凝膠，EB染色，紫外燈下檢測(cè)電泳結(jié)果。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄（RT）取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液，加入1 μl Oligo （dT） 18，用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12 μl。于PCR儀上70 ℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻。依次加入4 μl 5×buffer、2 μl 10 mmol/L dNTPs、1 μl RNA inhibitor（Invitrogen公司產(chǎn)品）和1 μl 反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司產(chǎn)品），用槍抽吸混勻，于PCR儀上42 ℃保溫60 min，結(jié)束后80 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

1.3.4基因表達(dá)檢測(cè)用引物用于基因表達(dá)檢測(cè)的引物及其序列見(jiàn)表2。

1.3.5熒光定量PCR（qRT-PCR）取0.2 ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系（每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管）：12.5 μl 2×qPCR Mix（Invitrogen公司產(chǎn)品）、2.0 μl 7.5 μmol/L基因引物、2.5 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、8.0 μl ddH2O。將cDNA原液稀釋20倍，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)。采用10.0 μl體系，即5.0 μl SYBR Green Real-time PCR Master Mix，2.0 μl超純水，1.0 μmol/L的上游引物0.5 μl，1 μmol/L下游引物0.5 μl，2.0 μl稀釋后的cDNA。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，62 ℃退火22 s，72 ℃延伸20 s，共24個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)1次。每板做一個(gè)用高壓三蒸水和不加cDNA陰性模版的擴(kuò)增，以檢測(cè)水和試劑是否被污染。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

同期發(fā)情率統(tǒng)計(jì)：在LED光處理后的第14 d、28 d、42 d、56 d、78 d、90 d上午，采用外陰檢查法對(duì)母兔進(jìn)行同期發(fā)情效果鑒定。當(dāng)外陰出現(xiàn)大紅或深紅色則為發(fā)情，登記并統(tǒng)計(jì)發(fā)情母兔占該組實(shí)驗(yàn)兔的比率即為同期發(fā)情率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行處理和作圖，用SPSS 18.0軟件One-Way ANOVA法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

卵巢紅色大卵泡數(shù)量統(tǒng)計(jì)：在LED光處理后的第91 d早晨進(jìn)行屠宰，每組取5只實(shí)驗(yàn)兔統(tǒng)計(jì)兩側(cè)卵巢上紅色大卵泡數(shù)量，數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行處理和作圖，用SPSS 18.0軟件One-Way ANOVA法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：用2-△△Ct法進(jìn)行，將目的基因的Ct值，用內(nèi)參基因mRNA的Ct值進(jìn)行校對(duì)，計(jì)算目的基因的相對(duì)量。計(jì)算公式為：△△Ct=（CtTarget- CtTBP）X-（CtTarget-CtTBP）CK，式中，以對(duì)照組的目的基因CtTarget和內(nèi)標(biāo)基因CtTBP差值的平均值為參照進(jìn)行計(jì)算，X表示任意一個(gè)樣本。通過(guò)上述公式計(jì)算每一個(gè)樣本目標(biāo)基因的表達(dá)量，通過(guò)TBP校正計(jì)算相對(duì)于對(duì)照組的目的基因表達(dá)倍數(shù)。

2結(jié)果

2.1不同LED光色對(duì)母兔同期發(fā)情率的影響

母兔同期發(fā)情率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，LED白光組、LED紅光組、LED綠光組、LED藍(lán)光組和白熾燈光對(duì)照組同期發(fā)情率分別為75.13%±9.66%、85.64%±6.59%、80.98%±8.34%、78.31%±7.23%、64.75%±5.33%。LED紅光組母兔同期發(fā)情率與白熾燈光對(duì)照組及LED白光組相比，分別提高20.89個(gè)百分點(diǎn)和10.51個(gè)百分點(diǎn)，差異顯著（P<0.05）;LED紅光組母兔同期發(fā)情率與綠光組及藍(lán)光組相比，分別提高4.66個(gè)百分點(diǎn)和和7.33個(gè)百分點(diǎn)，差異不顯著（P>0.05）。

2.2不同LED光色對(duì)母兔紅色大卵泡數(shù)量的影響

不同LED光色對(duì)母兔卵巢上紅色大卵泡數(shù)量的影響如圖1所示，LED紅光組母兔卵巢上紅色大卵泡數(shù)量有增加趨勢(shì)，但各個(gè)試驗(yàn)組間卵巢上紅色大卵泡數(shù)量差異不顯著（P>0.05）。

2.3不同LED光色對(duì)母兔垂體GnRHR基因、卵巢FSHR、LHR基因 mRNA表達(dá)的影響

與白織燈光、LED白光、LED綠光、LED藍(lán)光相比，LED紅光能促進(jìn)母兔垂體GnRHR mRNA表達(dá)，但差異不顯著（P>0.05）;與LED白光、LED綠光、LED藍(lán)光相比，LED紅光顯著提高了卵巢組織中FSHR、LHR 基因mRNA的表達(dá)（P<0.05）;與白熾燈光相比，LED紅光有提高卵巢組織中FSHR、LHR 基因mRNA表達(dá)水平的趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）（圖2）。

2.4不同LED光色對(duì)母兔卵巢各級(jí)卵泡數(shù)量的影響

卵巢組織結(jié)構(gòu)由生殖上皮白膜、皮質(zhì)和髓質(zhì)3部分組成。卵巢表面被覆了扁平或立方型的生殖上皮細(xì)胞，下為白膜結(jié)構(gòu)，由結(jié)締組織構(gòu)成（圖3）。卵巢外周是HE染色較深的皮質(zhì)部位，其中包含不同階段的卵泡、結(jié)締組織和血管，其中原始卵泡（PrF）及初級(jí)卵泡（PF）分布于皮質(zhì)表層。原始卵泡呈圓形或卵圓形，由1個(gè)卵母細(xì)胞和1層扁平卵泡細(xì)胞構(gòu)成，分布于皮質(zhì)層外周，呈聚集狀，數(shù)量密集;初級(jí)卵泡比原始卵泡體積大，形態(tài)呈柱狀或立方狀，層次明顯，直徑大小差異較大，多分散分布于皮質(zhì)表層，數(shù)量較多;次級(jí)卵泡（SF）的卵泡膜逐漸增厚且內(nèi)外層清晰，腔內(nèi)顆粒細(xì)胞逐漸增加，排列呈疏松狀，腔內(nèi)的卵母細(xì)胞被顆粒細(xì)胞緊密包圍，形成完整的透明帶，多分布于皮質(zhì)中層，由于卵泡逐級(jí)閉鎖，數(shù)量與原始卵泡（PrF）及初級(jí)卵泡（PF）相比數(shù)量顯著降低;當(dāng)卵泡腔里的卵泡液逐漸增多時(shí)，次級(jí)卵泡開(kāi)始向三級(jí)卵泡過(guò)渡，隨著卵泡腔的增大和卵泡液的增多，卵泡直徑顯著增大，卵母細(xì)胞開(kāi)始向卵泡一側(cè)靠近，與緊密包裹的顆粒細(xì)胞共同形成卵丘，三級(jí)卵泡（TF）突出于皮質(zhì)表層，由于卵泡進(jìn)一步閉鎖，數(shù)量顯著減少。試驗(yàn)中未觀察到完整結(jié)構(gòu)的成熟卵泡，只見(jiàn)到排卵后的巨大卵泡腔。

原始卵泡分布于皮質(zhì)層外周，呈聚集狀分布（圖4）。在原始卵泡（PrF）階段與初級(jí)卵泡（PF）階段，不同LED光色對(duì)其數(shù)量的影響差異不顯著（P>0.05）;次級(jí)卵泡（SF）數(shù)量與原始卵泡（PrF）及初級(jí)卵泡（PF）相比，由于卵泡逐級(jí)閉鎖，數(shù)量顯著降低，不同組間開(kāi)始出現(xiàn)差異，與LED綠光組及LED藍(lán)光組相比，LED紅光組、LED白光組及白熾燈光對(duì)照組次級(jí)卵泡（SF）數(shù)量顯著增加（P<0.05）;由于卵泡進(jìn)一步閉鎖，與原始卵泡（PrF）、初級(jí)卵泡（PF）以及次級(jí)卵泡（SF）相比，三級(jí)卵泡（TF）數(shù)量顯著減少，不同組間三級(jí)卵泡（TF）數(shù)量也呈現(xiàn)不同差異，與LED綠光組、LED藍(lán)光組及白熾燈光對(duì)照組相比，LED紅光組三級(jí)卵泡（TF）數(shù)量顯著增加（P<0.05），但與LED白光組相比，差異不顯著（P>0.05）。

2.5不同光色對(duì)母兔卵泡凋亡基因FoxO1 mRNA表達(dá)的影響

不同LED光色對(duì)母兔卵泡凋亡基因FoxO1 mRNA表達(dá)影響如圖5所示。與LED綠光相比，LED紅光及白熾燈光能顯著抑制母兔卵巢FoxO1 mRNA表達(dá)（P<0.05）;與LED白光及LED藍(lán)光相比，LED紅光及白熾燈光有抑制母兔卵巢FoxO1 mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）。

2.6Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)模式及不同LED光色對(duì)母兔卵巢Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的影響

圖6顯示，Bcl-2、 Bax 2個(gè)凋亡相關(guān)基因在兔卵巢中均有表達(dá)，但兩者的表達(dá)量有顯著差異（P<0.05），Bax mRNA表達(dá)量顯著高于Bcl-2 mRNA表達(dá)量。不同LED光色對(duì)兔卵巢Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的影響也存在差異，與LED綠光、藍(lán)光及白熾燈光相比，LED紅光顯著提高Bcl-2 mRNA的表達(dá)量（P<0.05），但與LED白光相比，差異不顯著（P>0.05），Bcl-2基因的表達(dá)量受到不同光色的影響呈現(xiàn)紅光>白光>白熾燈光>綠光>藍(lán)光;不同LED光色對(duì)Bax mRNA的表達(dá)影響呈現(xiàn)綠光>藍(lán)光>白光>白熾燈光>紅光，但各組間差異不顯著（P>0.05）。

3討論

3.1不同LED光色對(duì)母兔同期發(fā)情及紅色大卵泡數(shù)量的影響

哺乳動(dòng)物中，繁殖周期的級(jí)聯(lián)起源從促性腺激素釋放激素（GnRH）節(jié)律性釋放開(kāi)始[2]。發(fā)情前期，GnRH分泌進(jìn)入垂體門脈引起垂體節(jié)律性釋放促卵泡素（FSH）以及促黃體素（LH），引發(fā)發(fā)情及誘導(dǎo)排卵。Nakao等[3]、Anand等[4]、Takahashi[5]研究認(rèn)為，要觸發(fā)HPG通道，以下2種輸入類型是必不可少的：（1）卵泡成熟過(guò)程中雌二醇反饋調(diào)節(jié);（2）光信號(hào)通過(guò)顱內(nèi)核心分子晝夜振蕩器形成的反饋回路，調(diào)節(jié)松果體褪黑激素（MLT）分泌，進(jìn)而影響GnRH脈沖式分泌調(diào)節(jié)下游生殖軸一系列的反應(yīng)。Renstrm等[6]、Lee等[7]、Herm等[8]研究結(jié)果顯示，機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)的節(jié)律性變化受光信息等環(huán)境因素控制，如褪黑激素（MLT）等松果體激素可經(jīng)血液循環(huán)和腦脊髓液擴(kuò)散至丘腦下部，節(jié)律性抑制GnRH的分泌。在此基礎(chǔ)上，曹靜等[9]采用單一光譜證實(shí)，MLT影響雞下丘腦GnRH的表達(dá)是通過(guò)調(diào)控顱內(nèi)鐘基因Clock/Cry1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但董錫文等[10]的研究結(jié)果提示，由于禽類與哺乳動(dòng)物在光信號(hào)接受上存在差異性，兔是否也具有這一調(diào)控通路仍未知。就家兔而言，如何利用光信息調(diào)節(jié)其自身繁殖節(jié)律，從而實(shí)現(xiàn)無(wú)人工激素的周期化繁殖模式，關(guān)鍵在于如何控制下丘腦GnRH分泌引起垂體FSH、LH節(jié)律性釋放，誘發(fā)母兔發(fā)情。

目前，與單色光對(duì)禽類繁殖性能影響的研究相比[11-14]，光色對(duì)兔繁殖性能影響的研究相對(duì)較少，更多集中在光周期對(duì)兔繁殖性能的影響。如Szendr等[15]發(fā)現(xiàn)在規(guī)模兔場(chǎng)中授精前8 d將8 h光照變?yōu)?6 h光照能有效增加母兔發(fā)情率，但其并未進(jìn)一步研究光的顏色對(duì)母兔繁殖的影響。朱慈根等[16]選擇健康新西蘭母兔，隨機(jī)分成3組進(jìn)行不同補(bǔ)光時(shí)間對(duì)母兔繁殖性能的影響試驗(yàn)，結(jié)果顯示人工授精前3 d與人工授精前7 d補(bǔ)光處理差異不顯著，與激素處理相比，均能顯著提高母兔同期發(fā)情率、發(fā)情配種數(shù)及懷孕數(shù)。宋亞鵬[17]選用1 120只伊拉母兔，隨機(jī)分為2組，在人工授精前進(jìn)行7 d的光照處理，每天16 h，試驗(yàn)結(jié)果表明，LED白光組同期發(fā)情率、受胎率與節(jié)能燈組相比差異顯著，其試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了白色LED燈光對(duì)提高母兔繁殖性能的效果要優(yōu)于白熾燈光，說(shuō)明LED光源控制母兔同期發(fā)情技術(shù)完全能應(yīng)用到商品肉兔的繁殖生產(chǎn)中。李士棟 [18]對(duì)不同補(bǔ)光方式的哺乳期母兔生產(chǎn)性能進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在夏季使用LED燈補(bǔ)光的母兔受胎率和產(chǎn)仔率比使用節(jié)能燈的母兔高5%。崔雙保等[19]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，LED光源顯著提高了母兔同期發(fā)情率、受胎率、產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、出生窩質(zhì)量、斷奶窩質(zhì)量。Kalaba等[20]發(fā)現(xiàn)紅光對(duì)母兔繁殖性能及仔兔生長(zhǎng)性能的影響顯著，與自然光相比，紅光試驗(yàn)組母兔產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)仔率、仔兔初生質(zhì)量、存活率、斷奶質(zhì)量、斷奶個(gè)數(shù)及斷奶存活率最高，并且紅光組母兔血漿中褪黑激素（MLT）、促卵泡素（FSH）、雌二醇（E2）濃度最高，表明紅光可增加母兔繁殖性能及仔兔存活率。本試驗(yàn)采用LED光處理母兔，觀察不同光源及不同LED光色對(duì)母兔同期發(fā)情的影響，試驗(yàn)結(jié)果與上述類似，發(fā)現(xiàn)LED紅光組母兔同期發(fā)情率與白熾燈光對(duì)照組及LED白光組相比，分別提高20.89個(gè)百分點(diǎn)和10.51個(gè)百分點(diǎn)，差異顯著;LED紅光組母兔同期發(fā)情率與綠光組和藍(lán)光組相比，分別提高4.66個(gè)百分點(diǎn)和和7.33個(gè)百分點(diǎn)，但差異不顯著。綜上所述，LED光可用在規(guī)模兔場(chǎng)周期化繁殖生產(chǎn)模式中，并且能夠提高母兔的繁殖性能。

本研究發(fā)現(xiàn)，各LED光處理對(duì)母兔紅色大卵泡數(shù)量影響不顯著，推測(cè)母兔卵巢上紅色大卵泡繼續(xù)發(fā)育可能會(huì)排卵，因此初步將其定義為可能的排卵點(diǎn)。LED紅光組母兔紅色大卵泡數(shù)量比朱華萍等[21]報(bào)道的正常母兔排卵點(diǎn)數(shù)量（8.08±1.51）略高。

3.2不同LED光色對(duì)母兔垂體GnRHR及卵巢FSHR、LHR mRNA表達(dá)的影響

GnRHR、FSHR、LHR是與哺乳動(dòng)物繁殖性狀相關(guān)的3個(gè)重要候選基因[22-23]，Ramakrishnappa 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，GnRHR在下丘腦、垂體、卵巢內(nèi)均有表達(dá)，并且Zerani等[25]發(fā)現(xiàn)在家兔卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和透明帶內(nèi)均有GnRHR特異性受體的表達(dá)。FSHR和LHR在卵泡的發(fā)育和成熟中起重要作用。Parillo等[26]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR和LHR蛋白在家兔透明帶上均有表達(dá)。以上研究結(jié)果表明GnRHR、FSHR、LHR基因直接參與了家兔的繁殖調(diào)控。關(guān)于不同光色對(duì)兔繁殖性能影響的研究報(bào)道較少，更多研究集中在光周期與光照度對(duì)于母兔繁殖及其相關(guān)基因的影響。張玉仙等 [27]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)光照處理組母兔下丘腦GnRHR mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)，下丘腦所分泌的GnRHR是調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)的核心，表明不同光周期能顯著調(diào)控家兔的繁殖過(guò)程，此外在母兔垂體中長(zhǎng)光照組母兔GnRHR mRNA 表達(dá)量較短光照組和對(duì)照組顯著升高。孫良展[28]研究發(fā)現(xiàn)，在60 lx、80 lx、100 lx這3種光照度下，母兔卵巢中FSHR、LHR基因的表達(dá)沒(méi)有顯著差異，其原因可能是60 lx、80 lx、100 lx這3組的光照度差異不大，導(dǎo)致基因表達(dá)結(jié)果無(wú)顯著性差異。本研究發(fā)現(xiàn)LED紅光能促進(jìn)母兔垂體GnRHR mRNA表達(dá)，但差異不顯著，但與LED白光、綠光、藍(lán)光相比，LED紅光處理顯著提高了卵巢組織中FSHR、LHR 基因mRNA的表達(dá)，表明不同LED光色對(duì)母兔垂體GnRHR，卵巢FSHR、LHR 基因mRNA表達(dá)的影響存在差異。在兔生產(chǎn)中正確利用這一差異性，將能顯著提高家兔規(guī)?；a(chǎn)時(shí)周期化繁殖的效率。

3.3不同LED光色對(duì)母兔卵泡閉鎖及卵巢FoxO1 mRNA表達(dá)的影響

長(zhǎng)期以來(lái)研究人員圍繞遺傳及環(huán)境因素引起的雌性哺乳動(dòng)物卵泡閉鎖進(jìn)行了大量的研究。早期研究主要圍繞卵泡閉鎖形態(tài)以及生化特征變化上，包括不同程度閉鎖卵泡的外部形態(tài)及組織學(xué)變化、激素及生長(zhǎng)因子等水平變化[29-31]。隨著對(duì)卵泡閉鎖研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖伴隨著卵泡顆粒細(xì)胞大量調(diào)亡過(guò)程，其中由環(huán)境因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的研究已取得重要進(jìn)展。劉紅林等 [32]認(rèn)為叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1（FoxO1）是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。Shen [33]發(fā)現(xiàn)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致小鼠卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平顯著升高，小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖率同時(shí)上升。上述結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1基因可能在氧化應(yīng)激引起小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與LED紅光及白熾燈光相比，LED綠光能顯著促進(jìn)母兔卵巢FoxO1 mRNA表達(dá)。紅光波長(zhǎng)較其他可見(jiàn)光長(zhǎng)，其攜帶的能量少，照射視網(wǎng)膜后引起的氧化應(yīng)激作用沒(méi)有其他波長(zhǎng)的光強(qiáng)烈，因此氧化應(yīng)激小。LED紅光組FoxO1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于其他組，推測(cè)不同LED光處理后母兔機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)存在差異，這種差異的產(chǎn)生可能是由于不同波長(zhǎng)LED光所攜帶的光子能量不同而引起的，不同能量LED光在進(jìn)入視網(wǎng)膜后引起的生物學(xué)效率不一致，導(dǎo)致母兔卵巢中FoxO1 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)差異，而這一差異產(chǎn)生的結(jié)果直接體現(xiàn)在各組間有腔卵泡（三級(jí)卵泡）的數(shù)量上。與LED綠光組、LED藍(lán)光組及白熾燈光對(duì)照組相比，LED紅光組顯著提高了三級(jí)卵泡（TF）數(shù)量，說(shuō)明LED紅光在降低三級(jí)卵泡閉鎖進(jìn)程中起一定作用。

總之，環(huán)境因素可作為誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的原因，誘導(dǎo)動(dòng)物有腔卵泡閉鎖，氧化應(yīng)激通過(guò)增加轉(zhuǎn)錄因子FoxO1在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)下游細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致雌性動(dòng)物顆粒細(xì)胞的凋亡與卵泡閉鎖。

3.4不同LED光色對(duì)母兔卵巢Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的影響

Dharma等[34]、Wasowska等[35]、Van Cruchten等[36]、Liu等[37]的研究結(jié)果顯示，整個(gè)發(fā)情周期中，雌性動(dòng)物卵巢上卵泡動(dòng)態(tài)發(fā)育-閉鎖過(guò)程與顆粒細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Zhu等[38]和Zhang等[39]的研究結(jié)果顯示，影響顆粒細(xì)胞凋亡的因素主要有2大類：內(nèi)源的促凋亡或抗凋亡因子的調(diào)控以及外在的凋亡誘發(fā)因素（如激素刺激等），其中線粒體內(nèi)源凋亡發(fā)生在卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中，占整個(gè)凋亡過(guò)程的主導(dǎo)地位，此過(guò)程由Bcl-2蛋白家族介導(dǎo)。Bcl-2原癌基因是與細(xì)胞凋亡極為相關(guān)的關(guān)鍵基因之一，它能阻斷細(xì)胞凋亡的最后通路，而其家族成員Bax基因則具有與Bcl-2基因相反的功能，可加速細(xì)胞凋亡[40]?；蚯贸囼?yàn)證明，Bax能引起卵泡閉鎖，敲除Bax基因后卵泡數(shù)量增加[41]，說(shuō)明生殖細(xì)胞凋亡受到抑制;此外，敲除Bcl-2基因的小鼠體內(nèi)初級(jí)卵泡數(shù)量減少[42]，若Bcl-2過(guò)度表達(dá)，則可引起出生后小鼠體內(nèi)卵泡數(shù)目提高[43]，說(shuō)明Bcl-2有促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。Figueroa等[44]和Vartak等[45]研究發(fā)現(xiàn)，Bax和Bcl-2的比值是細(xì)胞凋亡開(kāi)關(guān)，二者的平衡決定了卵泡發(fā)育或是閉鎖。Bax/Bcl-2比值較高時(shí)，形成異源二聚體，抑制凋亡;Bax/Bcl-2比值較低時(shí)，或者當(dāng)Bax/Bcl-2之間的作用被破壞時(shí)，形成Bax/Bax同源二聚體，誘導(dǎo)凋亡。

本研究選擇這2個(gè)明確功能的基因，觀察母兔在不同LED光色下兩者表達(dá)特征，結(jié)果顯示，這2個(gè)凋亡相關(guān)基因在不同光處理的兔卵巢中均有表達(dá)，但兩者的相對(duì)表達(dá)量差異顯著，并呈現(xiàn)相反特征，表明兔卵泡發(fā)育過(guò)程中，其閉鎖過(guò)程占主導(dǎo)，絕大多數(shù)卵泡在發(fā)育過(guò)程中都經(jīng)歷閉鎖過(guò)程，極少部分形成了優(yōu)勢(shì)卵泡。此外，不同LED光色對(duì)兔卵巢Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)的影響也存在差異，與其他組相比，LED紅光組Bax mRNA表達(dá)顯著降低。這一結(jié)果也提示LED紅光在降低兔卵巢次級(jí)卵泡向三級(jí)有腔卵泡發(fā)育過(guò)程中的閉鎖程度上起到一定作用，驗(yàn)證了卵巢中Bcl-2和Bax基因直接參與母兔發(fā)情過(guò)程中卵泡的發(fā)育與閉鎖，而優(yōu)勢(shì)卵泡在發(fā)育過(guò)程中，由于FSH的作用，卵泡中顆粒細(xì)胞大量合成和分泌雌激素，血液中雌激素水平不斷升高，并且Bax/Bcl-2比值不斷變化，推測(cè)不同LED光色對(duì)Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)影響的差異可能直接促進(jìn)了母兔發(fā)情狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

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（責(zé)任編輯：張震林）