莫巖君，張羽墨，于天源，邵帥，沈熠，羅宇婷，呂桃桃

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京市 100029

感覺功能障礙是周圍神經(jīng)損傷后常出現(xiàn)的異常癥狀，其中最常見的主訴之一就是疼痛。臨床上大多數(shù)鎮(zhèn)痛藥副作用大，如聽力損傷[1]、胃腸道不良反應(yīng)[2]、易產(chǎn)生成癮性[3]等，推拿能夠恢復(fù)周圍神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的痛覺功能障礙[4‐6]。趨化因子(C‐X3‐C 基元)配體1(chemokine(C‐X3‐C motif)ligand 1,CX3CL1)和趨化因子(C‐X3‐C 基元)受體1 (chemokine (C‐X3‐C motif) re‐ceptor 1,CX3CR1)可以對(duì)神經(jīng)損傷產(chǎn)生的疼痛信息進(jìn)行傳遞，調(diào)控疼痛相關(guān)行為。趨化因子CX3CL1 通過與CX3CR1 結(jié)合，直接調(diào)節(jié)外周和中樞感覺神經(jīng)元興奮性，在疼痛的產(chǎn)生和維持過程中發(fā)揮重要作用。CX3CR1 也可以使小膠質(zhì)細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活形成疼痛的初級(jí)必由信號(hào)通路。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[7‐12]，推拿可以改善坐骨神經(jīng)損傷(sciatic nerve injury,SNI)大鼠的冷感覺、痛覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙。推拿對(duì)周圍神經(jīng)損傷后疼痛的產(chǎn)生和維持的作用機(jī)理尚不完全清楚。本研究通過檢測(cè)大鼠脊髓背角CX3CL1/CX3CR1 的蛋白和基因變化，以期驗(yàn)證“三法三穴”推拿手法對(duì)SNI 大鼠痛覺功能障礙的改善是否是通過對(duì)趨化因子CX3CL1/CX3CR1表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

74 只雄性Sprague‐Dawley 大鼠從北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)入，許可證號(hào)SCXK(京)2016‐0002，體質(zhì)量(200±10) g，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)單位許可證號(hào)SYXK(京)2016‐0038。濕度45%～55%，人工照明12 h (7:00‐19:00)，黑暗環(huán)境12 h(19:00‐7:00)，室內(nèi)恒溫24 ℃，先正常飼養(yǎng)1 周，使大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

本實(shí)驗(yàn)全部程序都遵守動(dòng)物倫理和福利原則，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)用和管理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

按摩推拿手法模擬儀：專利號(hào)200710187403.1。電泳/轉(zhuǎn)盒、多功能成像儀：美國(guó)BIO‐RAD 公司。M2多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)MOLECULAR DEVICES公司。低溫離心機(jī)、移液槍：德國(guó)EPPENDORF 公司。-80 ℃冰箱：美國(guó)THERMO FISHER 公司。轉(zhuǎn)移脫色搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。OSE‐Y30 高速組織電動(dòng)研磨器：中國(guó)天根生化科技有限公司。定量PCR 試劑：南京諾唯贊生物科技有限公司。Line Gene 9600plus 熒光定量PCR 儀：中國(guó)博日。JY04S‐3C型凝膠成像儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。CM1950 冰凍切片機(jī)：德國(guó)LEICA 公司。Eclipse 80i 熒光顯微鏡：日本尼康。PL200 型熱刺痛儀：成都泰盟。

水合氯醛：滬試公司。CX3CL1 抗體、CX3CR1抗體、CD11b抗體、山羊抗兔二抗、N Cadherin 抗體、彩虹marker、ECL Western blotting 底物試劑盒、封片劑：英國(guó)ABCAM 公司。驢抗小鼠熒光二抗Alexa Fluor 555：IMMUNOWAY 生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑：北京索萊寶。10%聚丙烯酰胺凝膠預(yù)混液：江蘇新賽美。2X Cham Q SYBR COLOR qPCR Master Mix(Q411‐02/03)：南京諾唯贊。PCR 引物：上海生工生物。Ex Taq 酶、dNTP(BK6501A)：中國(guó)寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。OCT冷凍包埋劑：美國(guó)櫻花。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將74 只大鼠分為正常組(n=12)、假手術(shù)組(n=24)、模型組(n=25)和三法三穴組(n=13)。

1.3.2 造模

假手術(shù)組、模型組和三法三穴組于造模前1 d 在右坐骨結(jié)節(jié)處備皮，配備10%水合氯醛溶液，造模前12 h 禁食。造模當(dāng)日大鼠腹腔麻醉區(qū)域消毒后，10%水合氯醛溶液3.5 ml/kg腹腔注射。大鼠右坐骨結(jié)節(jié)附近消毒，表皮切開后找到坐骨神經(jīng)，使其暴露。模型組和三法三穴組用特制持針鉗夾持暴露的坐骨神經(jīng)中段，滿扣夾5 s(力量約為50 N)，形成長(zhǎng)約2 mm 的神經(jīng)損傷點(diǎn)。假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，不人為損傷，后進(jìn)行消毒縫合。

1.3.3 干預(yù)

正常組、假手術(shù)組和模型組自造模后第7 天起行抓握束縛，每天9 min。束縛10 d，休息1 d，共束縛20 d。

三法三穴組造模后第7 天起開始干預(yù)。用手法模擬儀對(duì)大鼠右側(cè)殷門、承山、陽(yáng)陵泉三穴進(jìn)行點(diǎn)法、撥法、揉法三法刺激，力量約4 N。每法每穴各1 min，共9 min。干預(yù)10 d休息1 d，共干預(yù)20 d。

1.4 行為學(xué)測(cè)定

于造模后7 d、干預(yù)20 d，每組取6 只大鼠進(jìn)行光熱耐痛閾測(cè)定。于造模后7 d、干預(yù)10 d 和干預(yù)20 d，假手術(shù)組、模型組和三法三穴組每組取6 只大鼠，進(jìn)行累積疼痛評(píng)分。

1.4.1 一般情況

造模后各組健康狀況良好，切口部無紅腫、無感染。造模后1 d，假手術(shù)組兩后肢基本正常，活動(dòng)尚可，模型組和三法三穴組患肢跛行，膝關(guān)節(jié)呈被迫伸直狀態(tài)，足下垂，不能彎曲，表示模型制備成功。造模后7 d，假手術(shù)組活動(dòng)自如，模型組和三法三穴組患肢跛行，患肢足輕度外翻、懸空，不能觸地。干預(yù)20 d，假手術(shù)組活動(dòng)不受限；模型組活動(dòng)困難，患肢腓腸肌萎縮明顯，膝關(guān)節(jié)僵直，患足攣縮，足掌不能觸地，跛行；三法三穴組活動(dòng)良好，患足可觸地，腓腸肌萎縮不明顯，略跛行。

1.4.2 光熱耐痛閾

將大鼠放入熱刺痛儀觀測(cè)盒內(nèi)，待其平靜后，將熱輻射點(diǎn)瞄準(zhǔn)右足跖部中后1/3 處，即刻計(jì)時(shí)，當(dāng)大鼠后足不能忍耐熱度抬腳舔足時(shí)，計(jì)時(shí)停止，記為熱痛縮腿反應(yīng)潛伏期(paw withdrawal latency,PWL)。全程保持安靜，室溫約24 ℃，為避免燙傷大鼠足部，自動(dòng)停止計(jì)時(shí)為20 s。每只測(cè)3次，取平均值。

1.4.3 累積疼痛評(píng)分

將大鼠置于20×20×20 cm 透明觀測(cè)盒內(nèi)，觀察大鼠后足的負(fù)重著地情況。后足著地并且負(fù)重(負(fù)重為后足著地被壓迫發(fā)白)，計(jì)為0 分；后足著地但不負(fù)重，計(jì)為1 分；后足不著地，計(jì)為2 分。每次觀測(cè)1 min，記錄其最習(xí)慣保持的姿勢(shì)，間隔5 min 記錄1次，共觀測(cè)1 h，記錄12 次數(shù)據(jù)，以右足評(píng)分減去左足評(píng)分所得值的總和為累積疼痛評(píng)分。每只大鼠測(cè)3次，取平均值。

1.5 取材

第1 次新鮮取材于造模后7 d，隨機(jī)抓取正常組6只、假手術(shù)組12 只、模型組12 只。腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg 進(jìn)行麻醉，取出脊髓腰膨大L4～L6節(jié)段，剝離硬脊膜，立即放于凍存管，快速于液氮中速凍，全部取材后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱長(zhǎng)期保存。取材分配：Western blotting 檢測(cè)正常組6 只，假手術(shù)組6 只，模型組6只；RT‐PCR檢測(cè)假手術(shù)組6只，模型組6只。

第2 次新鮮取材于干預(yù)20 d 后，取材方法同第1次，正常組6只，假手術(shù)組12只，模型組12只，三法三穴組12 只。模型組和三法三穴組再各取1 只進(jìn)行4%多聚甲醛溶液灌注取材，組織放入30%濃度的蔗糖溶液中脫水，備用。取材分配：Western blotting 檢測(cè)正常組6只，假手術(shù)組6只，模型組6只，三法三穴組6 只；RT‐PCR 檢測(cè)假手術(shù)組6 只，模型組6 只，三法三穴組6 只；免疫熒光染色模型組1 只，三法三穴組1只。

1.6 分子生物學(xué)檢測(cè)

1.6.1 Western blotting

將脊髓背角L4～L6節(jié)段組織置于含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的高效RIPA 組織裂解液中，在冰上用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿，成糊狀，4 ℃、12 000 r/min離心1 h，取上清液，分裝待用。用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)濃度，根據(jù)說明書采用微孔酶標(biāo)儀法操作，用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)蛋白濃度配平。按預(yù)混膠說明書配比濃度為10%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣10 μl，加入適量1×電泳緩沖液，120 V，電泳1 h。1×電轉(zhuǎn)液，100 V，電轉(zhuǎn)2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h。根據(jù)彩 虹Marker的條帶指示，按Anti‐CX3CR1、Anti‐CX3CL1 和Anti‐N Cadherin (內(nèi)參)分子量大小將電轉(zhuǎn)后 的PVDF膜剪開，加入Anti‐CX3CR1 (1∶1000)、Anti‐CX3CL1 (1∶1000)、Anti‐N Cadherin (1∶6000)在搖床上孵育1 h，而后放入4 ℃冰箱過夜。12～16 h后取出，用1倍的TBST洗10 min，重復(fù)3次。二抗(1∶3000)孵育1 h，而后清洗同前。用ECL 試劑盒滴適量顯影液，曝光，拍照保存。

1.6.2 RT‐PCR

采用“Trizol+氯仿”一步法抽提脊髓背角總RNA，用微量核酸測(cè)定儀測(cè)RNA 濃度，濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。引物序列見表1。按比例配制主混液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)，用博日LineGene9600plus 型熒光定量PCR儀，變性(95 ℃、30 s)，復(fù)性(60 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、40 s)，循環(huán)35 次。得到熒光PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖，計(jì)算目的基因相對(duì)定量CT 值。內(nèi)參照是β‐actin。

1.7 免疫熒光染色

脊髓沉糖脫水后，用OCT包埋劑對(duì)脊髓腰膨大組織包埋，切片厚度30 μm，平貼于載玻片上，不要重疊，晾干，用1 倍TBS 洗10 min，重復(fù)3 遍。Block‐ing buffer 封閉1 h，加CD11b(1∶100)一抗標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，孵育3 d，洗3 遍，同前。加驢抗小鼠二抗(Al‐exa Fluor 555)，過夜，次日洗片3 遍，封片，觀察，拍照。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Image J軟件計(jì)算Western blotting目的蛋白條帶積分光密度值(integrated optical density,IOD)。計(jì)算RT‐PCR的2‐ΔΔCT值。采用SAS 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(±s)呈現(xiàn)。當(dāng)多組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布且方差齊時(shí)用單因素方差分析和LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。當(dāng)兩組數(shù)據(jù)都呈正態(tài)分布，同時(shí)滿足方差齊時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差不齊時(shí)用非參數(shù)Kruskal‐Wallis檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 光熱耐痛閾

造模后7 d，假手術(shù)組和模型組光熱耐痛閾高于正常組(P<0.05)，模型組高于假手術(shù)組(P<0.05)。干預(yù)20 d 后，模型組光熱耐痛閾高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)，三法三穴組高于正常組，低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組光熱耐痛閾比較(s)

2.2 累積疼痛評(píng)分

造模后7 d，模型組和三法三穴組累積疼痛評(píng)分高于假手術(shù)組(P<0.05)。干預(yù)10 d和20 d后，模型組和三法三穴組累積疼痛評(píng)分高于假手術(shù)組(P<0.05)，三法三穴組低于模型組(P<0.05)。從三個(gè)時(shí)間點(diǎn)橫向來看，模型組呈逐漸上升趨勢(shì)，三法三穴組干預(yù)10 d后呈下降趨勢(shì)。見表3。

2.3 Western blotting

造模后7 d，各組間CX3CR1 蛋白表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)；干預(yù)20 d 后，模型組較7 d 時(shí)有明顯的上升趨勢(shì)，但各組間無顯著性差異(P>0.05)，三法三穴組低于模型組，且接近于正常組和假手術(shù)組，但無顯著性差異(P>0.05)。見表4和圖1。

造模后7 d，各組CX3CL1蛋白的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)；干預(yù)20 d后，假手術(shù)組蛋白表達(dá)量有下降趨勢(shì)，模型組有上升趨勢(shì)，但各組間無顯著性差異(P>0.05)。見表5和圖2。

2.4 RT‐PCR

造模后7 d，與模型組相比，假手術(shù)組CX3CR1的mRNA 表達(dá)高于模型組，但無顯著差異(P>0.05)；干預(yù)20 d后，三法三穴組和模型組mRNA 表達(dá)相比有下降趨勢(shì)，但無顯著性差異(P>0.05)。見表6。

造模后7 d，與模型組相比，假手術(shù)組CX3CL1的mRNA 表達(dá)高于模型組，但無顯著差異(P>0.05)；干預(yù)20 d后，三法三穴組與模型組mRNA 表達(dá)相比有下降趨勢(shì)，但無顯著性差異(P>0.05)。見表7。

2.5 免疫熒光染色

干預(yù)20 d 后，模型組脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞突起較三法三穴組短，呈完全或部分活化狀態(tài)，部分胞體增大；三法三穴組脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞呈未活化或部分活化，有高分枝狀和桿狀，胞體較小，突起較長(zhǎng)。見圖3。

表3 各組累積疼痛評(píng)分比較(s)

圖1 各組CX3CR1蛋白表達(dá)(Western blotting)

圖2 各組CX3CL1蛋白表達(dá)(Western blotting)

表4 各組CX3CR1蛋白表達(dá)量(IOD)

表5 各組CX3CL1蛋白表達(dá)量(IOD)

表6 各組CX3CR1的mRNA表達(dá)

表7 各組CX3CL1的mRNA表達(dá)

3 討論

本研究基于經(jīng)絡(luò)循行和解剖學(xué)知識(shí)，篩選3 個(gè)能夠同時(shí)進(jìn)行肌肉、神經(jīng)和穴位干預(yù)的最佳部位：承山屬于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)，位于坐骨神經(jīng)分支脛神經(jīng)和腓腸肌附近；殷門屬于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)，位于坐骨神經(jīng)干上和股二頭肌附近；陽(yáng)陵泉屬于足少陽(yáng)膽經(jīng)，位于坐骨神經(jīng)分支腓總神經(jīng)上和脛前肌附近。

本課題組前期工作已經(jīng)證實(shí)推拿對(duì)SNI 大鼠的感覺和運(yùn)動(dòng)功能改善作用。冼思彤等[7]研究發(fā)現(xiàn)，“三法三穴”推拿對(duì)SNI 大鼠背根節(jié)降鈣素基因相關(guān)肽(cal‐citonin gene‐related peptide,CGRP)有升高作用，從而改善痛覺功能障礙。魯夢(mèng)倩等[8]觀察到“三法三穴”推拿干預(yù)后，SNI 大鼠神經(jīng)的修復(fù)和再生與損傷點(diǎn)軸索、髓鞘和施萬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的改變有密切的關(guān)系。張林峰等[9]研究表明，“三法三穴”推拿可抑制SNI 大鼠脊髓和損傷點(diǎn)處的髓鞘堿性蛋白的表達(dá)，修復(fù)髓鞘，改善其運(yùn)動(dòng)功能。高玉峰等[10]研究認(rèn)為，“三法三穴”推拿改善SNI 大鼠運(yùn)動(dòng)功能是通過提高神經(jīng)絲蛋白M (neurofilament M,NF‐M)和微管相關(guān)蛋白2 (microtubule‐associated protein,MAP‐2)的表達(dá)來調(diào)節(jié)的。李易真等[11]研究認(rèn)為，“三法三穴”推拿對(duì)SNI 大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善可通過降低勿動(dòng)蛋白受體(Nogo receptor,NgR)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。吳帥等[12]研究認(rèn)為，推拿可以抑制SNI 大鼠冷感覺過敏反應(yīng)。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上著眼于推拿改善痛覺功能障礙的機(jī)制，試圖說明CX3CL1/CX3CR1 蛋白和基因變化是否與痛覺障礙改善有關(guān)。

圖3 各組干預(yù)20 d小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)(免疫熒光染色，×400)

CX3C 亞型中的CX3CL1，也稱FKN(fractalkine)，是此亞型的唯一組成，它的受體是CX3CR1[13]。CX3CL1 主要在感覺神經(jīng)元中表達(dá)，背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角是主要表達(dá)部位[14‐15]。Zhu等[16]研究表明，在炎癥狀態(tài)下，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中CX3CL1 也可以表達(dá)。CX3CR1 誘導(dǎo)后可以活化脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞[17]。多種病理性疼痛產(chǎn)生和癥狀維持都與趨化因子及其受體CX3CL1/CX3CR1 參與有密切關(guān)聯(lián)。脊神經(jīng)結(jié)扎、坐骨神經(jīng)炎性神經(jīng)病、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷等神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中均已驗(yàn)證CX3CL1/CX3CR1 的表達(dá)調(diào)節(jié)與神經(jīng)損傷導(dǎo)致疼痛有關(guān)。Sun 等[18]研究表明，CX3CL1 通過脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶5 的磷酸化來調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷引起的疼痛反應(yīng)。Zhou等[19]研究認(rèn)為，坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠可溶性FKN 水平隨著FKN mRNA 水平的增加而明顯上調(diào)，調(diào)節(jié)病理性疼痛相關(guān)行為，且減少了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。Old 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)春新堿誘發(fā)疼痛的小鼠模型中，趨化因子CX3CL1 激活CX3CR1，從而激活感覺神經(jīng)元受體TRPA1。Clark 等[21]研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞的介質(zhì)Ca‐thepsin S 對(duì)通過跨膜趨化因子CX3CL1 的裂解維持神經(jīng)性疼痛至關(guān)重要。

本研究結(jié)果表明，“三法三穴”推拿手法對(duì)SNI大鼠的痛覺功能有明顯改善，但CX3CL1/CX3CR1 的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于干預(yù)方式的不同導(dǎo)致起效途徑不同，也可能是神經(jīng)損傷模型的差異。推拿是體外刺激，其起效機(jī)制可能是多途徑多靶點(diǎn)共同調(diào)節(jié)，推拿起效的關(guān)鍵機(jī)制還有待全面探索。

周圍神經(jīng)損傷會(huì)觸發(fā)與小膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān)的傷害性行為，其中小膠質(zhì)細(xì)胞的重要作用不容忽視[22]。周圍神經(jīng)損傷后，CX3CL1 在脊髓中裂解并與CX3CR1 偶聯(lián)，從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞[23]。神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞可以被傷害性刺激激活，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活最直接的變化表現(xiàn)在形態(tài)上，其活化狀態(tài)與損傷程度有關(guān)[24]。部分激活或未激活的小膠質(zhì)細(xì)胞呈分支狀，小膠質(zhì)激活后細(xì)胞胞體變大，突起短縮，形態(tài)上呈圓形或桿狀；繼續(xù)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞突起逐漸縮短甚至消失，阿米巴狀小膠質(zhì)，并有特殊功能，如吞噬[25]。FKN 誘導(dǎo)的疼痛調(diào)節(jié)可能一部分通過脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞‐神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)[26]。免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)元與非神經(jīng)元細(xì)胞之間的相互信號(hào)通路的阻斷為疾病修飾和更有效的疼痛發(fā)展機(jī)制提供新思路[27‐28]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，干預(yù)20 d 后三法三穴組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)上呈部分激活或未激活狀態(tài)，而模型組呈完全活化或部分活化狀態(tài)。

本研究證實(shí)“三法三穴”推拿可以改善SNI 大鼠的痛覺功能，但不通過趨化因子CX3CL1/CX3CR1 的表達(dá)調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變可能是通過其他途徑。推測(cè)行為學(xué)與生物化學(xué)檢測(cè)結(jié)果不一致的原因可能是本實(shí)驗(yàn)樣本量不足，推拿干預(yù)與其他干預(yù)方式的不同而導(dǎo)致作用機(jī)制差異，或是對(duì)SNI 大鼠痛覺障礙的改善可能是直接通過小膠質(zhì)細(xì)胞或者神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的，包括細(xì)胞表型受體，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，以及參與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的疼痛行為和背角神經(jīng)元過度興奮性的擴(kuò)散因子的作用。Abdo等[29]通過光遺傳學(xué)技術(shù)最新研究發(fā)現(xiàn)“疼痛感受性施萬細(xì)胞”，此研究改變了以往對(duì)感覺細(xì)胞認(rèn)識(shí)，對(duì)于研究疼痛的作用機(jī)制意義深遠(yuǎn)。對(duì)本研究有啟發(fā)意義，接下來研究“三法三穴”推拿手法改善坐骨神經(jīng)損傷大鼠痛覺障礙的機(jī)制可以嘗試運(yùn)用光遺傳技術(shù)以及從小膠質(zhì)細(xì)胞和疼痛感受性施萬細(xì)胞入手，為本研究打開了新思路。