南海珍，黃 磊，蔡 謹(jǐn)，徐志南

(浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實驗室，浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027)

1 前 言

1893年TIEMANN等[1]從鳶尾精油中分離出一種氣味宜人的酮類化合物，將它命名為鳶尾酮(irone)。鳶尾酮具有柔和的甜香，香氣清新純正，因具有特殊的紫羅蘭香味而被廣泛用于化妝品、香水、煙草和食品等行業(yè)[2-4]。鳶尾酮為無色或淡黃色透明液體，分子式為 C14H22O，不溶于水，易溶于乙醇等有機(jī)溶劑。新鮮鳶尾根莖無鳶尾酮特征香氣，一般需將生長3年后的鳶尾根莖在常溫下貯存2～3年甚至更長時間，鳶尾酮的前體物質(zhì)才能逐漸轉(zhuǎn)化為鳶尾酮[5]。在陳化鳶尾根莖中鳶尾酮以α-鳶尾酮、β-鳶尾酮和γ-鳶尾酮3種異構(gòu)體的形式存在，其中大部分為α-鳶尾酮和γ-鳶尾酮，β-鳶尾酮的含量較少[6]。α-鳶尾酮具有天然鳶尾凝脂的香味，香氣淡雅，鳶尾精油中α-鳶尾酮含量越高其價格越高[6-7]。鳶尾植物中鳶尾酮的生物合成途徑目前還不明晰，有報道推測鳶尾根莖中的某些三萜化合物(iridals)可能是鳶尾酮的前體物質(zhì)，單環(huán)iridals開鏈末端的雙鍵先經(jīng)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)，隨后環(huán)化形成鳶尾酮[4，8]。

從陳化的鳶尾根莖中直接提取是目前鳶尾酮的主要獲取方法。鳶尾根莖陳化需要占用大量存儲空間，長期保存容易出現(xiàn)霉變、蟲蛀等問題，且根莖中鳶尾酮含量極少，植物提取法得率低，所得產(chǎn)品價格高昂，無法滿足日益增長的市場需求[9-11]?；瘜W(xué)合成鳶尾酮方法普遍存在途徑冗長、收率低、生產(chǎn)成本高和生產(chǎn)過程污染較大等問題[12]。生物合成法具有條件溫和、操作簡單、綠色環(huán)保等優(yōu)勢。張玲琪等[13-15]嘗試從陳化的香根鳶尾根狀莖干片中分離得到兩株能產(chǎn)香的枯草芽孢桿菌，但僅做了菌種鑒定的研究，隨后又篩選出多株能產(chǎn)香的真菌，經(jīng)鑒定為米根霉，但固體發(fā)酵所產(chǎn)凈油成分中鳶尾酮只占 3.87%，且無具體鳶尾酮產(chǎn)量數(shù)據(jù)報道。目前鳶尾酮的生物合成研究尚處于實驗室階段，篩選所得菌株存在合成效率低和生產(chǎn)性能不穩(wěn)定等問題。

本文選擇浙江磐安種植的香料用鳶尾作為鳶尾酮合成菌的分離對象，從其陳化根莖中分離能產(chǎn)鳶尾酮的菌株，并對得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和16S rDNA基因序列分析。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化和上罐發(fā)酵提高菌株利用新鮮鳶尾為底物合成鳶尾酮的能力，為建立微生物發(fā)酵新鮮鳶尾根莖快速生產(chǎn)鳶尾酮提供了一條新路徑。

2 材料及方法

2.1 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基(g?L-1)：Tryptone 10，Yeast Extract 5，NaCl 10，Agar 15～20。

PDA 培養(yǎng)基(g?L-1)：Potato 200，Glucose 20，Agar 15～20。

復(fù)篩培養(yǎng)基(g?L-1)：MS培養(yǎng)基[16]，Glucose 10，鳶尾根粉30(晾干后粉碎過100目篩)。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g?L-1)：Yeast Extract 5，(NH4)2SO45，K2HPO41.5，KH2PO41，NaCl 1，MgSO4?7H2O 0.5，CaCl20.05，鳶尾根粉30。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g?L-1)：Glycerol 10，K2HPO41.5，KH2PO41，NaCl 1，MgSO4?7H2O 0.5，CaCl20.05，鳶尾根粉 30。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g?L-1): Beef Extract 3，Peptone 10，NaCl 1，鳶尾根粉30。

甘油混合培養(yǎng)基，簡稱甘油培養(yǎng)基(g?L-1)：Glycerol 10，Peptone 10，K2HPO41.5，KH2PO41，NaCl 1，MgSO4?7H2O 0.5，CaCl20.05，鳶尾根粉 30。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g?L-1)：Glycerol 10，Peptone 10，K2HPO41.5，KH2PO41，NaCl 1，MgSO4?7H2O 0.5，CaCl2 0.05，鳶尾根粉5，以上培養(yǎng)基120 ℃滅菌20 min。

2.2 試劑

α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)品，99%純度，瑞士奇華頓公司；色譜純甲醇，美國Simga公司；新鮮和陳化3年的鳶尾植物根莖，浙江磐安天藍(lán)香料廠；正己烷，美國Simga公司；其他化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.3 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(HPLC)，Agilent1100，安捷倫科技公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS)，GCMS-QP2010SE，日本島津；10 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；紫外可見光分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；高溫滅菌鍋，YXQ-LWS-SH，上海博訊實業(yè)有限公司；低溫離心機(jī)，Thermo Scientific公司。

2.4 菌種的篩選

將陳化2～3年的鳶尾根莖切成5 mm×5 mm大小的方塊，75%乙醇消毒5 min，無菌水洗滌后置于LB、PDA固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)。待切口邊緣長出菌落時，用平板劃線法純化獲取單菌落。挑取菌落至復(fù)篩培養(yǎng)基，30 ℃、180 r?min-1條件下培養(yǎng)72 h后HPLC檢測細(xì)胞中鳶尾酮的含量。獲得產(chǎn)鳶尾酮的菌株再次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗證并作GCMS定性分析。

2.5 鳶尾生香菌的鑒定

將篩選獲得的菌株接種至LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。提取目標(biāo)菌株基因組，用細(xì)菌通用引物27F，1492R進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增，引物基因序列如下：

27F：5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCA -3' ；1492R：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3'。測序后用 BLAST(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov) 程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對分析，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

將保存的菌種平板劃線活化，挑單菌落接入裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，28 ℃、200 r?min-1培養(yǎng) 24 h，接種 1% 的種子液進(jìn)行液體發(fā)酵，采用單因素實驗的方法優(yōu)化發(fā)酵條件，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)速、溫度、時間和根粉添加量，發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測OD值(option density，OD)及鳶尾酮的含量。

2.7 10 L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)

將保存的菌種劃線活化，挑取單菌落接入裝有300 mL LB培養(yǎng)基的1 000 mL搖瓶中，28 ℃、200 r?min-1培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵種子液。采用分批發(fā)酵的模式在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵(裝液量6 L)，28 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速200～400 r?min-1，通氣量3 L?min-1，利用氨水和鹽酸控制pH為7.0，發(fā)酵36 h，每3 h取樣，通過HPLC檢測樣品中的鳶尾酮的含量。

2.8 產(chǎn)物提取及分析

發(fā)酵液離心 (4 ℃、1 000 r?min-1、5 min)去除培養(yǎng)基中的根粉。收集的細(xì)胞和培養(yǎng)基混合液再次離心(4 ℃、8 000 r?min-1、5 min)，收集細(xì)胞沉淀并用蒸餾水洗滌兩遍。用正己烷重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液體積分?jǐn)?shù)為φB=1:1，30 ℃，200 r?min-1條件下萃取1 h，萃取液進(jìn)行HPLC和GCMS分析。

HPLC條件：色譜柱為Agillent SB-C18反向色譜柱(5 μm×4.6 mm×250 mm)，流動相75%甲醇，流速1 mL?min-1，柱溫為25 ℃，吸收波長為230 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

GCMS條件：毛細(xì)管氣相色譜柱SH-Rxi-5 Sil MS柱 ( 0.25 mm × 30 m ×0.25 μm)，載氣氦氣，流速50 mL?min-1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流，程序升溫過程：初溫50 ℃，保留1 min，終溫220 ℃，保留5 min，升溫速率5 ℃?min-1。電子轟擊源EI，電離能量70 EV，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍為40～400，1 μL進(jìn)樣量。GCMS所獲得質(zhì)譜信息與NIST數(shù)據(jù)庫的比較分析后，確認(rèn)其中的化學(xué)成分。

2.9 鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷稀釋成一系列濃度后進(jìn)樣，繪制順式α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。經(jīng)過線性擬合所得的回歸方程為Y=26 164.84X-38.45，其線性相關(guān)系數(shù)為0.998，因此在0.01～0.10 mg?mL-1具有良好線性。

圖1 順式α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of cis-α-irone standard

3 實驗結(jié)果和討論

3.1 鳶尾生香菌的篩選

α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜結(jié)果如圖2所示，峰 1的保留時間為 17.516 min，峰 2的保留時間為19.077 min。核磁共振氫譜結(jié)果顯示峰1為反式α-鳶尾酮，峰2為順式α-鳶尾酮，表明此α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)品中存在順式和反式2種異構(gòu)體。

圖2 α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of α-irone standard

從陳化鳶尾根莖中初篩分離得到15株細(xì)菌和8株真菌。復(fù)篩經(jīng)HPLC檢測獲得一株產(chǎn)順式α-鳶尾酮的細(xì)菌，發(fā)酵72 h后細(xì)胞提取物和加入內(nèi)標(biāo)樣品經(jīng)液相色譜分析(見圖3)，結(jié)果顯示細(xì)胞提取物中峰3和α-鳶尾酮標(biāo)準(zhǔn)品中順式α-鳶尾酮(峰2)的保留時間非常接近。進(jìn)一步將細(xì)胞提取物做GCMS分析，鳶尾酮分子量為206.42，峰3對應(yīng)物質(zhì)經(jīng)過質(zhì)譜分析出現(xiàn)分子量206的響應(yīng)值，質(zhì)譜信息與NIST數(shù)據(jù)庫的比較后，確認(rèn)該物質(zhì)為α-鳶尾酮(見圖4)。圖中，m/z為質(zhì)量電荷比。

3.2 菌種鑒定

將篩選獲得的菌株接種至LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落呈圓形，表面及邊緣粗糙，呈乳白色，蠟狀，菌株革蘭氏染色結(jié)果表明其為革蘭氏陽性菌(見圖5)。

圖3 細(xì)胞提取物液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of cell extracts

圖4 細(xì)菌發(fā)酵樣品GCMS圖Fig.4 Gas chromatography-mass spectrometry curve of bacterial fermentation materials

擴(kuò)增所得菌株16S rDNA的長度為1 454 bp，經(jīng)BLAST程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)比對，顯示該菌株與簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex strain)菌株的同源性高達(dá)99%，將其命名為 YWT-5。利用 MEGA 7.0軟件按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，YWT-5菌株與登錄號為KY312780的Bacillus simplex strain GT38的親緣關(guān)系最近，處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分枝(見圖6)，因此鑒定該菌為簡單芽孢桿菌。

圖5 YWT-5菌株的形態(tài)特征Fig.5 Morphological features of the YWT-5 strain

圖6 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的YWT-5菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogentic tree based on 16S rDNA gene sequences of the YWT-5 strain

3.3 碳氮源對鳶尾酮產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程中培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分會影響菌株的生長和產(chǎn)物的合成。在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添 1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油，在氮源源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1%的酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨，考察各種碳氮源對產(chǎn)物合成的影響作用。培養(yǎng)72 h后測定發(fā)酵液中順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量，如表1所示，所檢測的各種碳源和氮源對順式α-鳶尾酮合成的影響差別不大，產(chǎn)量均在50 mg?kg-1左右。在后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化實驗中，選取10 g?L-1甘油和10 g?L-1蛋白胨分別作為培養(yǎng)基的碳氮源。

表1 不同碳源、氮源對順式α-鳶尾酮產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of different carbon and nitrogen sources on the yields of cis-α-irone mg?kg-1

3.4 搖床轉(zhuǎn)速對鳶尾酮產(chǎn)量的影響

在不同轉(zhuǎn)速條件下，順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量如圖7所示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160～220 r?min-1時，隨著轉(zhuǎn)速增大，YWT-5菌株發(fā)酵液中順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在200 r?min-1時順式α-鳶尾酮含量最高，可達(dá)到56.02 mg?kg-1。提升轉(zhuǎn)速有利于提高培養(yǎng)基中的溶氧和物質(zhì)交換效率，但細(xì)胞也容易在高轉(zhuǎn)速條件下被剪切力所破壞，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到220 r?min-1時順式α-鳶尾酮產(chǎn)量有所下降，只有46.66 mg?kg-1。因此后續(xù)實驗中選擇200 r?min-1作為YWT-5菌株搖瓶產(chǎn)順式α-鳶尾酮發(fā)酵的搖床轉(zhuǎn)速。

圖7 不同搖床轉(zhuǎn)速下順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量Fig.7 Yields of cis-α-irone under different rotating speeds

圖8 不同溫度下菌株的生長曲線Fig.8 Growth profiles of the strain under different temperatures

3.5 發(fā)酵溫度對YWT-5菌株的生長及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度會直接影響著菌體內(nèi)多種代謝酶的活性，從而影響菌體的生長及代謝產(chǎn)物的合成[16]，采用單因素實驗考察了發(fā)酵溫度對菌體生長及產(chǎn)物積累的影響。不同溫度下YWT-5菌株的生長曲線見圖8，較低的溫度不利于菌體的生長，28 ℃下細(xì)菌OD值相對較高，最大值可達(dá)到5.05，隨著溫度進(jìn)一步升高，菌體生長速度逐漸降低。不同發(fā)酵溫度條件下，順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量如圖9所示，和菌體生長情況規(guī)律相似，在28 ℃下順式α-鳶尾酮產(chǎn)量相對較高。因此選擇28 ℃作為YWT-5菌株生長的發(fā)酵溫度，此條件下順式α-鳶尾酮產(chǎn)量可達(dá)到63.73 mg?kg-1。

圖9 不同溫度條件下順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量Fig.9 Yields of cis-α-irone under different temperatures

圖10 不同時間菌體生長曲線及順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量Fig.10 Growth curves of the strain and yields of cis-α-irone under different temperatures

3.6 發(fā)酵時間對鳶尾酮產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程中隨著菌體的生長鳶尾酮不斷合成，發(fā)酵時間太短產(chǎn)物積累量少，而過長的發(fā)酵時間會導(dǎo)致菌體衰老甚至死亡。發(fā)酵時間對YWT-5菌株的生長和產(chǎn)物合成的影響如圖10所示，在0～24 h內(nèi)細(xì)菌快速生長，36 h后菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌生長放緩，OD在60 h時達(dá)到最大值5.07，隨后菌體進(jìn)入衰退期OD值下降。在0～24 h內(nèi)菌體密度快速增長時，順式α-鳶尾酮含量也迅速提高，24 h時順式α-鳶尾酮產(chǎn)量最高可達(dá)81.90 mg?kg-1，發(fā)酵24 h后雖然菌體OD值還在緩慢增加，但菌體中順式α-鳶尾酮的含量保持穩(wěn)定并逐漸緩慢降低?？赡苁且驗閾u瓶發(fā)酵中菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后順式α-鳶尾酮的合成能力下降，且部分產(chǎn)品被菌體消耗或發(fā)生了降解。

3.7 根粉添加量對鳶尾酮產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵過程中底物的添加量對發(fā)酵結(jié)果有重要的影響，新鮮鳶尾根莖中雖沒有鳶尾酮，但含有鳶尾酮的前體物質(zhì)iridals[5]。本實驗以新鮮鳶尾根粉作為底物進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)物產(chǎn)量隨著根粉添加量呈現(xiàn)出先增加后穩(wěn)定的趨勢(見圖11)。當(dāng)添加量從3提高到20 g?L-1時，順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量從1.49提高到1.93 mg?L-1，但產(chǎn)量的增加和根粉添加量不成正比關(guān)系，可見發(fā)酵中根粉添加已相對過量。特別是當(dāng)根粉添加量在30～40 g?L-1時，順式α-鳶尾酮產(chǎn)量基本保持不變。在添加5 g?L-1的根粉時，搖瓶中順式α-鳶尾酮產(chǎn)量為1.64 mg?L-1，相當(dāng)于每千克新鮮鳶尾根粉可產(chǎn)315.95 mg順式α-鳶尾酮。

圖11 不同根粉濃度下順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量Fig.11 Yields of cis-α-irone under different iris rhizomes concentrations

圖12 不同培養(yǎng)基中菌株的生長曲線Fig.12 Growth profiles of the strain in different media

3.8 發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

首先考察了LB、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和甘油混合培養(yǎng)基中菌株的生長和鳶尾酮的合成情況，菌株生長曲線如圖12所示，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中菌體生長較緩慢，最大OD值只有3.47，而菌株在甘油培養(yǎng)基中生長情況良好，能獲得較高的OD值，20 h左右菌體OD值達(dá)到6.26。發(fā)酵24 h時，甘油培養(yǎng)基中的順式α-鳶尾酮產(chǎn)量也相對較高，可達(dá)到93.32 mg?kg-1(見圖13)，因此選擇甘油培養(yǎng)基作為上罐的發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖13 不同培養(yǎng)基中順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量Fig.13 Yields of cis-α-irone in different media

圖14 菌體生長曲線及順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量Fig.14 Growth curves of the strain and yields of cis-α-irone

利用上罐發(fā)酵改善菌體培養(yǎng)環(huán)境，通過提高菌體培養(yǎng)密度解決底物過量問題，從而提高鳶尾酮的產(chǎn)量。在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵，發(fā)酵過程中菌體的生長曲線及鳶尾酮產(chǎn)量變化如圖14所示。當(dāng)6 h之后，菌體生物量顯著增加，進(jìn)入對數(shù)生長期，發(fā)酵18 h時OD達(dá)到最大值25.67，18 h后菌體量緩慢降低。發(fā)酵過程中順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量呈現(xiàn)出先上升后緩慢降低的趨勢，0～9 h產(chǎn)量緩慢增加，9～15 h菌體對數(shù)生長期內(nèi)順式α-鳶尾酮的產(chǎn)量增加迅速，15～18 h產(chǎn)量保持相對穩(wěn)定。18 h后隨著菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期直至衰退期，順式α-鳶尾酮產(chǎn)量也緩慢降低。發(fā)酵過程中根粉添加量為5 g?L-1，發(fā)酵18 h時順式α-鳶尾酮產(chǎn)量最高，可達(dá)到1 037.65 mg?kg-1，是相同根粉添加量時搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量(315.95 mg?kg-1)的3.28倍。

4 結(jié) 論

從鳶尾根莖中篩選到一株產(chǎn)香細(xì)菌，通過細(xì)菌16S rDNA基因序列分析確定為簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex strain)。該菌株可以發(fā)酵新鮮鳶尾根粉合成順式α-鳶尾酮，查閱文獻(xiàn)，這是簡單芽孢桿菌可用于順式α-鳶尾酮合成的首次報道。發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果顯示，當(dāng)添加5 g?L-1的新鮮根粉時，在28 ℃、200 r?min-1條件下，發(fā)酵24 h順式α-鳶尾酮搖瓶產(chǎn)量達(dá)到315.95 mg?kg-1。采用分批發(fā)酵模式，在10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵18 h后順式α-鳶尾酮產(chǎn)量可達(dá)1 037.65 mg?kg-1。本研究選用了浙江種植的香料用鳶尾，陳化2～3年后的根莖中總鳶尾酮含量約為300 mg?kg-1，其中順式α-鳶尾酮含量為169.02 mg?kg-1。相對于傳統(tǒng)的陳化提取工藝，YWT-5菌株利用新鮮根粉發(fā)酵生產(chǎn)鳶尾酮，不僅使生產(chǎn)周期由2～3年縮短至1 d，而且α-鳶尾酮的產(chǎn)量大為提高。本工作極大縮短了鳶尾酮的生產(chǎn)時間，降低了生產(chǎn)成本，同時分離得到的產(chǎn)香菌株也為后續(xù)解析鳶尾酮生物合成途徑的相關(guān)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。