許 娜，關今韜，張頌紅，贠軍賢，關怡新，姚善涇

(1.浙江工業(yè)大學 化學工程學院 綠色化學合成技術國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310032;2.浙江大學 化學工程與生物工程學院，浙江 杭州 310027)

1 引 言

苯乳酸是一種典型的高值有機酸，能抑制革蘭氏陰性菌、陽性菌和部分真菌的生長，具有良好的抗菌性，也是合成新型高分子材料聚苯乳酸的單體，還可以作為合成新藥的中間體，在化工、食品、材料、醫(yī)藥等領域具有重要用途[1-4]。由于化學法合成苯乳酸路徑復雜，存在較為嚴重的環(huán)境污染問題，目前尚不能大規(guī)模生產，而生物法合成苯乳酸條件溫和，工藝路線簡單，是近幾年國內外重點關注的研究方向[5-6]。但是，微生物發(fā)酵合成苯乳酸存在成本高、高產菌株缺乏、工業(yè)化困難等難題。酶法合成苯乳酸雖合成效率高于野生菌株，但其制備過程成本高，步驟復雜，穩(wěn)定性和安全性仍有待考究[7-8]。固定化全細胞生物催化劑將為解決上述問題提供新的發(fā)展方向，它將游離的微生物細胞通過化學或物理的方法截留在一定的有限的空間內，既可以保持微生物細胞原有的催化活性，又可以改善活性流失，具有易于分離、減輕底物抑制和提高穩(wěn)定性等優(yōu)點[9-14]。

晶膠介質是近年來出現的一種新型生物分離介質，內有尺寸數十到數百微米的超大孔隙并相互連通，在水中有良好的連通性和彈性，可以允許含有微生物細胞或細胞碎片的復雜料液通過，在生化分離領域具有廣闊的應用前景[15-18]。其中聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly(2-hydroxyethyl methacrylate)，pHEMA)晶膠具有生物相容性好、機械強度高、制備成本低等優(yōu)點。SAVINA等[19]提出pHEMA晶膠以其優(yōu)秀的力學性能，可以用作細胞培養(yǎng)支架載體；NIMET等[20]將干細胞包埋于HEMA復合葡聚糖晶膠，用于修復骨損傷；EFREMENKO等[14]利用聚乙烯醇晶膠復合用于釀酒酵母細胞長時間儲存。但是，將pHEMA晶膠用作制備生物催化劑合成苯乳酸，尚未見報道。

本文通過結晶致孔法制備pHEMA晶膠，然后在其骨架上接枝帶有胺基陰離子的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate，DMAEMA)得到陰離子交換晶膠，將該晶膠與微生物表面的負電基團通過靜電力吸附結合，制得復合生物催化劑，并考察了所得復合生物催化劑合成苯乳酸的能力。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

L-苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)、甲基丙烯酸羥乙酯(2-hydroxyethyl methacrylate，HEMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(poly(ethylene glycol) diacrylate，PEGDA)、四甲基乙二胺(N,N,N,N’–tetramethylethylenediamine，TEMED)、甲醇及牛血清白蛋白(Bovine albumin serum，BSA)購于Sigma公司；三氟乙酸、DMAEMA購于阿拉丁試劑；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、檸檬酸氫二銨及無水乙酸鈉購于生工生物工程有限公司；硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀、吐溫80及鹽酸購于華東醫(yī)藥股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

2.1.2 儀器

Agilent 1260 infinity高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent，美國)；CR21N高速冷凍離心機(Hitachi Koki，日本)；Milli-Q Synthesis超純水機(Millipore，美國)；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；HZ-2411KB疊式中型恒溫搖床(太倉市華利達實驗設備有限公司)；HS-1300-U超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；DW-HL290超低溫冷凍儲存箱(中科美菱)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；THD-3030低溫恒溫槽，寧波天恒儀器廠。

2.1.3 菌種和培養(yǎng)基

副干酪乳桿菌L.paracasei16C3菌株分離自泡菜，本課題組保藏。

肉湯培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)：葡萄糖20 mg?mL-1，蛋白胨10 mg?mL-1，酵母膏5 mg?mL-1，牛肉膏10 mg?mL-1，檸檬酸二胺 2 mg?mL-1，無水乙酸鈉 5 mg?mL-1，硫酸錳 0.25 mg?mL-1，硫酸鎂 0.58 mg?mL-1，磷酸氫二鉀 2 mg?mL-1，吐溫 801 mL?L-1。

2.2 實驗方法

2.2.1 陰離子交換晶膠制備

實驗使用的陰離子交換晶膠pHEMA-DMAEMA，采用課題組建立的結晶致孔、聚合反應和接枝修飾方法進行制備[16-17]。在直徑4～6 mm，高為10 mm的玻璃管中通過低溫冷凍結晶致孔制備得到晶膠基質，按3～5 mm的厚度切片，然后用濃度為0.5 mol?L-1的DMAEMA單體進行接枝而得。

2.2.2 陰離子交換晶膠基礎性能測試[21]

陰離子交換晶膠的孔隙率采用稱重法測定；吸附容量通過考察晶膠介質對模型蛋白BSA的吸附進行評價：用磷酸鹽緩沖液(0.02 mol?L-1，pH 7.2)在不同流速(1、2和3 cm?min-1)下進行吸附層析，測定陰離子交換晶膠介質的吸附容量，蛋白濃度的測量采用考馬斯亮藍法；晶膠介質內部結構通過掃描電鏡表征：將晶膠在不同體積濃度(10%～100%)的乙醇溶液中進行梯度脫水、冷凍干燥，然后用離子濺射儀進行噴金處理，最后用掃描電鏡觀察并拍攝照片。

2.2.3 復合生物催化劑的制備與微觀結構表征

將甘油保藏的副干酪乳桿菌菌株經活化一次，按6%接種量接種于肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃靜置培養(yǎng)8 h，再將干燥后的pHEMA陰離子交換晶膠投入發(fā)酵液，于35 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)16 h，瀝干晶膠表面水分，得到pHEMA種子晶膠。最后，將pHEMA種子晶膠投入肉湯培養(yǎng)基中，繼續(xù)35 ℃靜置培養(yǎng)48 h，瀝干晶膠表面水分，得到復合生物催化劑。其內部結構通過掃描電鏡進行表征，過程與上述晶膠介質相同。

2.2.4 復合生物催化劑發(fā)酵合成苯乳酸

將pHEMA種子晶膠于30 mL培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，以傳統(tǒng)發(fā)酵方式為對照實驗，每隔12 h(12、24、36、48、60、72和84 h)取樣，考察不同時間點發(fā)酵液中苯乳酸濃度。

2.2.5 復合生物催化劑轉化合成苯乳酸

復合生物催化劑和無晶膠的全細胞催化劑經透性化處理后，以5 mL 0.1 mol?L-1的PB 8.0緩沖溶液為底物溶液，葡萄糖濃度為2 mg?mL-1，調節(jié)苯丙氨酸濃度分別為0.5、1、2和3 mg?mL-1，搖床轉速為75 r?min-1，搖床控溫35 ℃，轉化48 h，考察2種生物催化劑生物轉化能力，其中復合生物催化劑的用量按其固載細胞的量為100 mg?mL-1計算，無晶膠的全細胞催化劑用量也為100 mg?mL-1。

3 結果與討論

3.1 陰離子交換晶膠的形態(tài)結構分析

圖1是陰離子交換晶膠切片的形貌特征和內部微觀結構掃描電鏡圖像。從圖中可見，pHEMA-DMAEMA陰離子交換晶膠內部具有相互連通的超大孔隙，其孔徑范圍為10～200 μm，介質壁面光滑。孔隙率反映了晶膠介質內流體流動空間的相對大小，以水為測試流體，測得該晶膠的有效孔隙率為 75.1%，絕干孔隙率為 82.7%，說明該晶膠介質孔隙空間大，相互連通形成了網絡結構，適用于微生物細胞的生長，有利于底物和代謝產物的交換和傳質。

圖1 陰離子交換pHEMA晶膠的形貌與微觀結構Fig.1 Morphology and microstructure of the anion exchange pHEMA cryogels

3.2 陰離子交換晶膠的吸附性能分析

文獻中常以BSA為模型蛋白，來間接評價陰離子交換晶膠介質吸附容量和吸附性能[15-18]。因此，以BSA為模型蛋白質，在不同流速條件下對pHEMA-DMAEMA晶膠介質的吸附性能進行了研究。用磷酸鹽緩沖液(0.02 mol?L-1，pH 7.2)平衡床柱，上樣蛋白濃度 1 mg?mL-1，洗脫液為 1 mol?L-1NaCl (相同磷酸鹽緩沖液配置)。不同流速下BSA的吸附曲線和吸附容量如圖2所示?？梢姡煌魉傧碌腂SA層析曲線無明顯差異，同時洗脫峰對稱性較好。通常，用于生物分離的pHEMA陰離子交換晶膠的吸附容量較大，例如DONG等[16]制備的pHEMA-DMAEMA晶膠，其在1、2和3 cm?min-1流速條件下對BSA的吸附容量分別為4.04、3.71和3.69 mg?mL-1。因此，通過控制接枝條件，適當降低吸附容量，以便適度吸附細胞，形成復合生物催化劑，結果見圖2(b)?？梢姡诹魉?、2和3 cm?min-1流速下，pHEMA-DMAEMA晶膠介質對BSA的吸附容量分別為0.75、0.63和0.62 mg?mL-1，說明pHEMA晶膠具有一定數量的陰離子交換基團，適于后續(xù)吸附細胞，適合用于制備復合生物催化劑。

圖2 不同流速下晶膠對BSA的吸附層析性能與吸附容量Fig.2 Chromatographic behaviors and BSA absorption capacities of the pHEMA-DMAEMA cryogel at various flow rates

3.3 晶膠副干酪乳桿菌復合生物催化劑表征

復合生物催化劑內部結構如圖3所示。由圖中可以看出，大量桿狀的副干酪乳桿菌在晶膠孔隙內沉積，并成堆生長，與晶膠孔隙內壁緊密結合。基于晶膠介質較大的比表面積和較多的吸附位點，形成了高濃度生物催化劑。

圖3 晶膠復合生物催化劑內部結構電鏡照片Fig.3 SEM micrographs of the cell-immobilized cryogel biocatalysts

3.4 復合生物催化劑發(fā)酵合成苯乳酸

通過高效液相色譜分析發(fā)酵上清液中的苯乳酸含量，濃度變化如圖4所示。從圖中可以看出，發(fā)酵開始后12 h內，代謝苯乳酸濃度快速上升后逐漸趨平，到24 h時，復合生物催化劑代謝的苯乳酸含量明顯高于傳統(tǒng)發(fā)酵下的細胞代謝，由0.71 mg?mL-1提升到0.95 mg?mL-1。圖5是復合生物催化劑發(fā)酵過程中生物量變化。由圖可見，按常規(guī)發(fā)酵，無晶膠時發(fā)酵液中的細胞生物量比較低，但隨時間呈穩(wěn)定上升趨勢；發(fā)酵36 h后，生物量趨于平衡，細胞干重最高為 2.83 mg?mL-1。而副干酪乳桿菌在pHEMA-DMAEMA陰離子交換載體中生長的速度迅速上升，經過72 h發(fā)酵，細胞干重達到最高，為7.10 mg?mL-1，細胞濃度是無晶膠常規(guī)發(fā)酵時的 2.5倍。因此，以離子交換晶膠為載體，利用晶膠對副干酪乳桿菌細胞的吸附作用，在發(fā)酵過程中可以形成高濃度生物催化劑，通過減輕底物抑制和提高酶系的穩(wěn)定性，提高了發(fā)酵過程的生物量，這與本課題組關于晶膠微球固定化細胞培養(yǎng)實驗效果一致[22]，進而提高了苯乳酸產量。

圖4 晶膠復合生物催化劑發(fā)酵與無晶膠發(fā)酵時產苯乳酸濃度的對比Fig.4 Comparison of PLA concentrations with and without cell-immobilized cryogel biocatalysts during fermentation synthesis

3.5 復合生物催化劑轉化苯丙氨酸合成苯乳酸

以苯丙氨酸為底物，利用復合生物催化劑進行生物轉化，在不同底物濃度下合成苯乳酸，如圖6所示。從圖中可見，當底物濃度為0.5 mg?mL-1時，復合生物催化劑轉化生成的苯乳酸的產量明顯大于全細胞催化下的產量，苯乳酸濃度最高為0.15 mg?mL-1，苯丙氨酸轉化率達30%，約為全細胞催化劑苯乳酸產量的3倍；當底物濃度為1 mg?mL-1時，復合生物催化劑的轉化能力仍然大于全細胞催化劑，苯乳酸濃度最高為0.23 mg?mL-1，轉化率可達 20%，約為全細胞催化劑下苯丙氨酸轉化率的2.5倍；當底物濃度為2 mg?mL-1時，苯乳酸濃度最高為0.23 mg?mL-1，苯丙氨酸轉化率可達 10%，約為全細胞催化劑苯丙氨酸轉化率 1.5倍；當底物濃度為3 mg?mL-1時，苯乳酸濃度最高為0.41 mg?mL-1，苯丙氨酸轉化率仍為10% 與全細胞催化劑轉化能力相當。 由此可以推斷，細胞表面帶負荷，晶膠骨架吸附位點通過離子交換作用將細胞固定在孔隙內表面，在一定程度上提高了細胞內酶系的穩(wěn)定性，從而提高了細胞對 PHE底物和苯乳酸產物抑制的耐受性；同時，復合生物催化劑內發(fā)達的孔隙有利于底物充分向細胞表面擴散[22]；當底物濃度越低時，單位體積晶膠內細胞生物量充足，大部分苯丙氨酸有較高的概率擴散到達細胞表面和內部，在酶的催化下進行轉化合成苯乳酸，轉化率高；隨底物濃度的增大，晶膠內細胞生物量不足以為所有的苯丙氨酸底物分子提供反應機會，一部分苯丙氨酸分子將不能到達酶位點，底物利用率低，從而轉化率下降，但合成的苯乳酸產物濃度仍然提高。

圖5 晶膠復合生物催化劑發(fā)酵與無晶膠發(fā)酵過程中細胞干重隨時間變化的對比Fig.5 Comparison of dried cell concentrations with and without cell-immobilized cryogel biocatalysts during fermentation synthesis

圖6 不同底物濃度下晶膠復合生物催化劑與使用全細胞催化劑轉化合成苯乳酸的對比Fig.6 Comparison of PLA concentrations and conversion ratios with cell-immobilized cryogel biocatalysts and whole-cell biocatalysts during biotransformation synthesis

4 結 論

利用陰離子交換功能 pHEMA-DMAEMA晶膠對副干酪乳桿菌的吸附作用，在發(fā)酵過程中可以形成高菌體濃度復合生物催化劑，能夠用于苯乳酸的發(fā)酵合成和轉化合成。pHEMA-DMAEMA晶膠內部有尺寸10～200 μm量級的超大孔隙，其相互連通且十分發(fā)達，有效孔隙率75.1%，絕干孔隙率為82.7%，對BSA蛋白吸附容量為0.75 mg?mL-1，適于吸附固定副干酪乳桿菌，并提供有利于菌體生長。復合生物催化劑發(fā)酵的生物量及苯乳酸產量均明顯高于常規(guī)游離細胞發(fā)酵情況，其生物量由常規(guī)的2.83 mg?mL-1提高到7.1 mg?mL-1，苯乳酸產量由常規(guī)的0.71 mg?mL-1提升到0.95 mg?mL-1。復合生物催化劑轉化生成的苯乳酸產量也明顯高于常規(guī)的全細胞催化劑，當底物苯丙氨酸的濃度為0.5 mg?mL-1時，苯丙氨酸轉化率高達30%，是全細胞催化劑的3倍；當底物苯丙氨酸的濃度為1 mg?mL-1時，苯丙氨酸轉化率可達20%，是全細胞催化劑的2.5倍；當底物苯丙氨酸的濃度增加至2 mg?mL-1時，苯丙氨酸轉化率為10%，是全細胞催化劑的 1.5倍。因此，復合型生物催化劑合成苯乳酸的性能明顯優(yōu)于常規(guī)全細胞催化劑，且制備過程簡單，分離容易，安全性好，易于放大，具有廣闊的應用前景。