周松，孫云靜，崔江漫，狄寧寧

邢臺(tái)市第三醫(yī)院，河北邢臺(tái)054000

心力衰竭是各種病因所致心臟疾病的終末階段，主要表現(xiàn)為呼吸困難、乏力、體液潴留等，可影響循環(huán)、呼吸等系統(tǒng)功能，嚴(yán)重者甚至危及生命。臨床上約50%心力衰竭患者可出現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化和心室肥厚，導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降、心室充盈壓升高、肺循環(huán)淤血等，而左室射血分?jǐn)?shù)是正常的或接近正常的，這部分病例被稱為左室射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭(HFpEF)患者[1,2]。肺動(dòng)脈高壓(PAH)是指肺動(dòng)脈壓力升高超過正常范圍、肺血管阻力進(jìn)行性增加的一種病理狀態(tài)[3]。有研究報(bào)道，超過2/3的心力衰竭患者可能合并PAH，而心力衰竭患者一旦合并PAH，其死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[3]。因此，早期診斷心力衰竭合并PAH，從而制定針對(duì)性干預(yù)措施，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類進(jìn)化上高度保守、長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，不編碼蛋白質(zhì)，但能通過抑制基因表達(dá)參與調(diào)控許多重要的病理生理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等[4～6]。miR-21屬于miRNA家族成員之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭患者成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)上調(diào)，其異常表達(dá)可促進(jìn)心肌纖維化和左心室肥厚[7]。由此推測(cè)，miR-21異常表達(dá)可能與HFpEF合并PAH有一定關(guān)系，但目前缺少相關(guān)證據(jù)。為此，本研究觀察了HFpEF并發(fā)PAH患者血漿miR-21水平變化，并分析其對(duì)HFpEF并發(fā)PAH的診斷價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月～2019年7月邢臺(tái)市第三醫(yī)院收治的HFpEF患者138例。所有患者符合2013年美國(guó)心臟病學(xué)學(xué)院基金會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)《心力衰竭治療指南》中關(guān)于HFpEF的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有典型心力衰竭癥狀和體征，左室射血分?jǐn)?shù)≥50%，心臟超聲、心導(dǎo)管檢查提示左心室舒張功能異常；②接受心臟多普勒超聲檢查；③臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①左室射血分?jǐn)?shù)<50%的心力衰竭者；②合并急性心肌梗死、肥厚型梗阻性心肌病、先天性心臟病等可能影響本研究結(jié)果的其他心臟疾病者；③合并急慢性炎癥反應(yīng)性疾病或自身免疫性疾病者；④妊娠期或哺乳期婦女。根據(jù)是否合并PAH[平均肺動(dòng)脈壓>25 mmHg和(或)肺動(dòng)脈收縮壓(PASP)>35 mmHg且肺動(dòng)脈楔壓(PCWP)<15 mmHg][9]分為HFpEF合并PAH組(PAH-HFpEF組)62例、HFpEF組76例。其中，PAH-HFpEF組男37例、女25例，年齡(61.93±10.22)歲，BMI (23.45±1.17)kg/m2；HFpEF組男43例、女33例，年齡(61.28±9.16)歲，BMI(23.04±1.39)kg/m2。同期選擇性別、年齡與HFpEF患者匹配的、在邢臺(tái)市第三醫(yī)院體檢健康的志愿者40例(對(duì)照組)，男23例、女17例，年齡(61.50±10.24)歲，BMI(23.27±1.28)kg/m2。三組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經(jīng)邢臺(tái)市第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或其家屬知情同意。

1.2 血漿miR-21檢測(cè) HFpEF患者入院次日采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫靜置30 min。采用QIAGEN miRNeasy Mini Kit提取血漿miRNA，并通過QIAGEN miScript Ⅱ RT Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，按熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-21上游引物5′-GTTAGCTTATCAGACTGA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度95 bp；內(nèi)參U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度95 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×Taqman通用PCR預(yù)混物10 μL，20×miRNA特異性引物1 μL，cDNA 1.33 μL，不含酶蒸餾水7.67 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共50個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集清晨空腹肘靜脈血，同法檢測(cè)血漿miR-21相對(duì)水平。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢查 采用Philips iE33型彩色多普勒超聲診斷儀，S5-1探頭，探頭頻率1.7～3.4 MHz。囑受檢者左側(cè)臥位，平靜呼吸，在左心室長(zhǎng)軸切面采用M型超聲測(cè)量左心房收縮末期內(nèi)徑(LAD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。以Devereux校正公式計(jì)算左心室質(zhì)量，進(jìn)一步計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。采用三尖瓣反流壓差法估測(cè)PASP，PASP=4V2+右心房壓力。其中，V為三尖瓣反流速度，右心房壓力通過下腔靜脈超聲獲得。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿miR-21水平及LVEDD、LAD、LVMI、PASP比較 見表1。

表1 各組血漿miR-21水平及LVEDD、LAD、LVMI、PASP比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與HFpEF組比較，#P<0.05。

2.2 HFpEF患者血漿miR-21水平與LVEDD、LAD、LVMI、PASP的關(guān)系 Pearson積矩相關(guān)分析顯示，HFpEF患者血漿miR-21水平與LAD、LVMI、PASP呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.578、0.632、0.671，P均<0.05)，而與LVEDD無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.3 血漿miR-21對(duì)HFpEF并發(fā)PAH的診斷效能分析 ROC曲線分析顯示，血漿miR-21診斷HFpEF并發(fā)PAH的曲線下面積為0.929(95%CI：0.892～0.966)，最佳截?cái)嘀禐?.35，此時(shí)其診斷敏感性為85%、特異性為93%、準(zhǔn)確性為88%。

3 討論

PAH是指肺動(dòng)脈壓力升高，而左心房與肺靜脈壓力正常，主要由肺小動(dòng)脈本身病變引起肺血管阻力增加所致，且不合并慢性呼吸系統(tǒng)疾病、慢性血栓栓塞性疾病及其他未知因素等導(dǎo)致的肺高血壓[10,11]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，HFpEF患者是PAH發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)人群[12]。PAH是導(dǎo)致HFpEF病情進(jìn)展的重要因素，但其早期無明顯癥狀和體征，確診時(shí)病情已較嚴(yán)重。目前，臨床上主要通過肺組織活檢或心導(dǎo)管檢查評(píng)價(jià)肺血管改變來確定是否并發(fā)PAH，但這些檢查往往具有滯后性，不能提前預(yù)測(cè)PAH的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找無創(chuàng)、簡(jiǎn)單、快捷的手段早期預(yù)測(cè)HFpEF并發(fā)PAH的風(fēng)險(xiǎn)，繼而制定針對(duì)性干預(yù)措施，對(duì)提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，miRNA與疾病的關(guān)系逐漸成為臨床研究的熱點(diǎn)。miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸，能夠通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)靶向結(jié)合從而抑制基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及器官形成、病毒防御等病理生理過程[13～15]。miR-21屬于miRNA家族成員之一，編碼基因位于人17號(hào)染色體上。有研究報(bào)道，在心力衰竭患者心肌成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)能夠通過抑制心肌成纖維細(xì)胞凋亡和促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2分泌而加速心室肥厚和心肌纖維化，而下調(diào)miR-21表達(dá)則可改善心室肥厚和心肌纖維化[7]。由此推測(cè)，miR-21異常表達(dá)可能與HFpEF并發(fā)PAH有一定關(guān)系，但目前缺少相關(guān)證據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAH-HFpEF組和HFpEF組血漿miR-21水平及LAD、LVMI、PASP均高于對(duì)照組，且PAH-HFpEF組上述指標(biāo)均高于HFpEF組，而三組LVEDD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示HFpEF患者存在不同程度心室肥厚和心肌纖維化，同時(shí)伴有左心房擴(kuò)大，從而刺激心肌成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞不斷分泌和釋放miR-21，故HFpEF并發(fā)PAH時(shí)肺血管受到損傷，從而使心肌細(xì)胞中miR-21表達(dá)上升。本研究中HFpEF患者血漿miR-21水平與LAD、LVMI均呈正相關(guān)關(guān)系，表明心肌肥厚能夠促進(jìn)血漿miR-21水平升高，而血漿miR-21水平與PASP呈正相關(guān)關(guān)系，提示血漿miR-21水平與肺動(dòng)脈收縮壓密切相關(guān)。LAD、LVMI與心肌肥厚和心肌纖維化密切相關(guān)，心肌纖維化可使左心室充盈壓升高，并傳導(dǎo)至肺靜脈使毛細(xì)血管楔壓升高導(dǎo)致PAH，也可能是心肌肥厚能夠加速肺血管重構(gòu)而致PAH[16]。本研究進(jìn)一步采用ROC曲線分析了血漿miR-21對(duì)HFpEF并發(fā)PAH的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿miR-21診斷HFpEF并發(fā)PAH的曲線下面積為0.929，最佳截?cái)嘀禐?.35，此時(shí)其診斷敏感性為85%、特異性為93%、準(zhǔn)確性為88%。提示miR-21可作為早期診斷HFpEF并發(fā)PAH的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，HFpEF并發(fā)PAH患者血漿miR-21水平明顯升高，其水平變化與超聲心動(dòng)圖檢查相關(guān)指標(biāo)具有較好的相關(guān)性。血漿miR-21可作為早期診斷HFpEF并發(fā)PAH的生物學(xué)指標(biāo)。但由于本研究為單中心的小樣本量研究，其結(jié)論尚需多中心、前瞻性、隊(duì)列研究進(jìn)一步驗(yàn)證。