張彬彬，劉晶晶，李丹，楊翠宏，馬濤，李娜

本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪117000

宮頸癌是一種臨床常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，主要發(fā)生于子宮頸鱗狀上皮或腺上皮。在我國，宮頸癌的發(fā)病率和病死率均居女性惡性腫瘤的第二位[1]。宮頸癌在治療上主要以手術治療和放化療為主，但即使經過規(guī)范的綜合治療，仍有部分患者出現(xiàn)術后局部復發(fā)或遠處轉移[2～4]。目前，宮頸癌發(fā)病的確切分子機制尚不清楚。因此，尋找與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的分子對其診斷和治療具有重要意義。干擾素基因刺激因子(STING)是固有免疫反應中的一種蛋白分子，在防御病毒或細菌感染、介導Ⅰ型干擾素產生等過程中具有重要作用[5]。有研究表明，在多種惡性腫瘤組織中均存在cGAS-STING通路過度激活現(xiàn)象，STING活化后通過抑制局部免疫細胞功能，促進腫瘤惡性進展[6]。CC類趨化因子22(CCL22)屬于趨化因子家族成員之一[7]，在輔助性T細胞向炎癥區(qū)域轉移、輔助性T細胞介導免疫反應等過程中發(fā)揮重要作用。有研究報道，CCL22表達升高能夠促進腫瘤細胞的免疫逃逸，并可導致患者預后不良[8]。吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)是色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶。有研究發(fā)現(xiàn)，IDO能夠通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中色氨酸代謝發(fā)揮免疫抑制作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中STING表達升高能夠激活絲裂原激活的蛋白激酶/活化蛋白1信號通路，促進CCL22、IDO表達，從而招募調節(jié)性T細胞，發(fā)揮免疫抑制作用[10]。但STING、CCL22、IDO表達與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關系尚不清楚。本研究觀察了宮頸癌組織STING、CCL22、IDO表達變化，并進一步探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年2月～2016年5月本溪市中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者83例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合宮頸癌診斷；②初診；③接受宮頸癌根治術；④術前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并結核、自身免疫性疾病或其他部位惡性腫瘤者；②心、肝、肺、腎等重要臟器嚴重功能不全者；③合并精神障礙性疾病者；④妊娠期或哺乳期婦女?；颊吣挲g32～72(48.1±10.3)歲，其中<45歲43例、≥45歲40例；病理類型：鱗癌70例，腺癌13例；FIGO分期[11]：Ⅰ期43例，Ⅱ、Ⅲ期40例；組織分化程度：高中分化52例，低未分化31例；肌層浸潤深度：淺肌層36例，深肌層47例；有淋巴結轉移37例，無淋巴結轉移46例。本研究經本溪市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 STING、CCL22、IDO表達檢測 采用RT-qPCR法。將手術切除的宮頸癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣≥3 cm且經組織病理檢查證實為正常宮頸組織)置于凍存管內，液氮轉運至-80 ℃冰箱保存，待組織成批。取凍存組織各約50 mg，液氮下研磨成粉，采用TRIzol法提取組織總RNA，經NanoDrop 2000超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：STING上游引物5′-GACTAAAGGACTGCCTGAAGGGA-3′，下游引物5′-GGCATTGTACATGGGATTAGCTCTG-3′；CCL22上游引物5′-TGGACAGCAGCAGCTGGGCC-3′，下游引物5′-CAGCTCAAGGGGCCGCATCG-3′；IDO上游引物5′-TCCAGCCAGGGRTTTTTGTG-3′，下游引物5′-CTTGTTGCCATGGAGTTGTGATC-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCTCAGATGTAACTGAGCTG-3′，下游引物5′-TAGCTCATCAACCGATCT-3′。PCR反應體系共20 μL：cDNA模板3 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 12 μL，ddH2O 3 μL；反應條件：95 ℃ 4 min，95 ℃ 30 s、58 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后采用門診、電話等形式定期隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪截至2019年5月，終點事件為患者死亡。統(tǒng)計患者生存時間，計算3年總體生存率。

2 結果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織STING、CCL22、IDO表達比較 見表1。

表1 宮頸癌組織與癌旁正常組織STING、CCL22、IDO相對表達量比較

注：與癌旁正常組織比較，*P<0.05。

2.2 宮頸癌組織STING、CCL22、IDO表達的關系 Pearson線性相關分析顯示，宮頸癌組織STING相對表達量與CCL22、IDO相對表達量均呈正相關關系(r分別為0.707、0.614，P均<0.05)，CCL22相對表達量與IDO相對表達量亦呈正相關關系(r=0.601，P<0.05)。

2.3 宮頸癌組織STING、CCL22、IDO表達與患者臨床病理特征的關系 見表2。

表2 宮頸癌組織STING、CCL22、IDO表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 宮頸癌組織STING、CCL22、IDO表達與患者預后的關系 至隨訪截至時間，共隨訪1～36個月，中位隨訪時間30.1個月，死亡19例，無失訪病例。

以宮頸癌組織STING、CCL22、IDO相對表達量的均數為臨界值，將患者分為STING、CCL22、IDO高表達者與低表達者。其中，STING高表達者41例、低表達者42例，CCL22高表達者40例、低表達者43例，IDO高表達者42例、低表達者41例。STING高表達者3年總體生存率為65.9%(27/41)，STING低表達者為88.1%(37/42)；CCL22高表達者3年總體生存率為57.5%(23/40)，CCL22低表達者為95.3%(41/43)；IDO高表達者3年總體生存率為61.9%(26/42)，IDO低表達者為92.7%(38/41)。STING、CCL22、IDO高表達者3年總體生存率均低于其低表達者(χ2分別為4.444、8.201、5.449，P均<0.05)。見圖1～3。

圖1 宮頸癌組織不同STING表達者預后的生存曲線

圖2 宮頸癌組織不同CCL22表達者預后的生存曲線

圖3 宮頸癌組織不同IDO表達者預后的生存曲線

3 討論

宮頸癌是發(fā)生于子宮頸鱗狀上皮或腺上皮的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高病死率等特征，是一種嚴重威脅女性生命健康的疾病。目前，宮頸癌發(fā)病的確切分子機制尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，如腫瘤微環(huán)境中的細胞通過表達免疫抑制性細胞因子或細胞表面分子，介導腫瘤細胞免疫逃逸[12]。因此，深入研究宮頸癌腫瘤微環(huán)境中的關鍵靶點或信號通路，對尋找早期診斷、靶向治療和預后評估的分子標志物具有重要意義。Liang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在舌鱗癌中，STING可能通過促進CCL22、IDO表達促進腫瘤惡性進展。但STING、CCL22、IDO表達與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關系尚不清楚。

STING又稱TMEM173、MPYS、MITA或ERIS，是一種存在于宿主細胞內質網膜上的跨膜蛋白。STING基因定位于人染色體5q31.2，其編碼蛋白能夠結合胞質中的雙鏈DNA，通過激活下游信號傳導，促進Ⅰ型干擾素表達，調節(jié)免疫細胞功能[13]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等組織中均存在STING異常高表達現(xiàn)象，其高表達通過影響干擾素等細胞因子產生，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用[14]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織STING相對表達量明顯高于癌旁正常組織，其原因可能是胞質中外源性或腫瘤本身的DNA分子能夠被cGAS識別，繼而催化三磷酸鳥苷和三磷酸腺苷合成cGAMP；cGAMP作為第二信使，能夠直接結合并激活STING，通過促進下游信號傳導，誘導機體對腫瘤細胞的免疫耐受，從而促進腫瘤細胞的惡性增殖[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織STING相對表達量均與FIGO分期、組織分化程度有關，而與年齡、病理類型、肌層浸潤深度和淋巴結轉移無關。提示宮頸癌臨床分期越高、組織分化程度越低，STING表達越高，其機制可能是STING活化后構象發(fā)生改變，由內質網轉運至高爾基體，招募TANK結合激酶1并結合轉錄因子干擾素調節(jié)因子3(IRF-3)，使IRF-3易位至細胞核內，促進IFN等下游基因轉錄，一方面通過促進上皮間質轉化相關基因的表達，促進腫瘤惡性進展，另一方面通過誘導局部形成抑制性免疫微環(huán)境，促進腫瘤細胞免疫逃逸，導致腫瘤細胞無限增殖[16]。因此，STING過表達與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究進一步分析了宮頸癌組織STING表達與患者預后的關系，結果發(fā)現(xiàn)STING高表達者3年總體生存率明顯低于STING低表達者，提示STING有可能成為預測宮頸癌患者預后的分子生物標志物。

CCL22基因定位于人染色體16q21，其編碼蛋白屬于趨化因子家族，對單核細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞和活化的T淋巴細胞具有明顯趨化作用。IDO基因定位于人染色體8p11.21，其編碼蛋白是色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，能夠作用于多種色氨酸底物，如D-色氨酸、L-色氨酸、5-羥色氨酸等，進而發(fā)揮調節(jié)T細胞功能的作用[17]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中CCL22表達升高能夠招募腫瘤相關巨噬細胞(TAM)，促進TAM中IDO表達，從而抑制局部殺傷性T淋巴細胞功能，促進腫瘤惡性進展[8]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織CCL22、IDO相對表達量均明顯高于癌旁正常組織，其原因可能是STING信號通路活化能夠促進CCL22、IDO表達。Ribechini等[18]研究發(fā)現(xiàn)，STING活化可促進下游干擾素調節(jié)因子1(IRF-1)表達，而IRF-1能夠結合到IDO基因干擾素刺激反應元件的轉錄調控元件，從而激活IDO基因轉錄。有研究報道，CCL22基因轉錄還受IFN信號通路的直接調控，IFN能夠促進CCL22基因表達，進而活化絲裂原激活的蛋白激酶通路，從而促進腫瘤細胞的惡性增殖[19]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織CCL22、IDO相對表達量均與FIGO分期、組織分化程度有關，而與年齡、病理類型、肌層浸潤深度和淋巴結轉移無關。結果表明，CCL22、IDO表達變化可能與宮頸癌惡性進展有關，其機制可能與二者在腫瘤免疫微環(huán)境中能夠發(fā)揮免疫抑制作用有關。Furudate等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中過表達的CCL22可招募調節(jié)性T細胞進入腫瘤免疫微環(huán)境，而調節(jié)性T細胞在發(fā)揮免疫抑制作用的同時，能夠協(xié)助腫瘤細胞逃避免疫細胞殺傷，使腫瘤細胞得以存活并快速增殖。Kato等[21]研究認為，腫瘤細胞IDO表達上調可導致腫瘤免疫微環(huán)境處于色氨酸饑餓狀態(tài)，使進入免疫微環(huán)境的效應T細胞出現(xiàn)細胞周期阻滯，繼而抑制效應T細胞增殖。Arumuggam等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在IDO的催化作用下色氨酸代謝過程會形成具有細胞毒性的代謝產物，T細胞在這些毒性代謝產物的作用下會溶解，繼而導致腫瘤細胞免疫受到抑制。因此，宮頸癌組織IDO表達上調可促進抑制抗腫瘤T細胞的增殖，從而抑制體內細胞免疫對宮頸癌細胞的殺傷作用，有利于宮頸癌細胞的存活和惡性增殖。本研究進一步分析了宮頸癌組織CCL22、IDO表達與患者預后的關系，結果發(fā)現(xiàn)CCL22、IDO高表達者3年總體生存率均明顯低于CCL22、IDO低表達者，提示CCL22、IDO高表達與宮頸癌患者預后不良有關，與Heeren等[23]報道基本一致。因此，CCL22、IDO有可能成為預測宮頸癌患者預后的分子生物標志物。

本研究結果還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織STING相對表達量與CCL22、IDO相對表達量呈正相關關系，其原因是STING作為IFN信號通路的上游分子，在激活IFN信號通路的同時，上調轉錄因子IRF-1表達，從而促進IDO、CCL22表達，發(fā)揮腫瘤免疫抑制作用[18]。此外，宮頸癌組織CCL22相對表達量與IDO相對表達量亦呈正相關關系，其原因可能是CCL22表達增加后，通過結合趨化因子受體4促進IDO表達[24]。

綜上所述，宮頸癌組織STING、CCL22、IDO高表達，其高表達與FIGO分期、組織分化程度和患者預后有關；三者表達變化可能協(xié)同促進宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。STING、CCL22、IDO有可能成為宮頸癌早期診斷、靶向治療和預后評估的分子標志物。