紀(jì)榮祖，常璠，劉春燕

西寧市第三人民醫(yī)院，西寧810005

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一組氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，主要表現(xiàn)為肺功能加速下降[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國40歲以上人群COPD的患病率為8.2%[2]。COPD急性加重期(AECOPD)通常指在疾病過程中，患者短期內(nèi)咳嗽、咳痰、氣短和(或)喘息急性加重，痰量增多，呈膿性或黏膿性。臨床研究證實，AECOPD能夠?qū)е路喂δ苎杆傧陆瞪踔羻适?，可?yán)重影響患者生活質(zhì)量，預(yù)后較差[3]。迄今為止，AECOPD的發(fā)病機制尚不完全清楚，可能與免疫功能失調(diào)和炎癥反應(yīng)等有關(guān)[4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(NLRs)是固有免疫系統(tǒng)的組成部分，能通過特異性識別病原相關(guān)分子模式來激活先天免疫系統(tǒng)，從而抵抗病原體入侵[5]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)是在N末端有2個半胱天冬酶補充結(jié)構(gòu)域的NLRs家族成員，能夠增強自我吞噬功能，在宿主免疫防御中具有重要作用。研究報道，NOD2能夠通過激活核因子κB(NF-κB)參與調(diào)控免疫反應(yīng)中的炎癥反應(yīng)[6]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)屬于NOD家族成員，是由NLRP3效應(yīng)蛋白Caspase-1及凋亡相關(guān)點樣蛋白構(gòu)成的復(fù)合體。NLRP3活化與炎癥性自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有研究證實，NOD2、NLRP3能夠參與炎癥性腸病等炎癥性疾病的發(fā)病過程[7,8]。但目前關(guān)于NOD2、NLRP3與AECOPD關(guān)系的報道較少。為此，本研究觀察了AECOPD患者外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3表達(dá)變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2019年1月西寧市第三人民醫(yī)院收治的AECOPD患者123例(AECOPD組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性阻塞性肺疾病診斷、處理和預(yù)防全球策略(2011年修訂版)》[9]，具有典型的AECOPD臨床表現(xiàn)，并經(jīng)肺功能檢查、動脈血氣分析等確診；②發(fā)病至入院時間<24 h；③年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤及心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者；②合并自身免疫性疾病、急慢性感染性疾病者；③合并其他可能影響本研究結(jié)果的肺部疾病，如肺纖維化、支氣管哮喘、肺結(jié)核等；④近期有重大外傷史或手術(shù)史者；⑤入院前接受過糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑等治療者；⑥有肺功能檢查禁忌證者；⑦妊娠期或哺乳期女性。其中，男73例、女50例，年齡34～79(57.95±11.26)歲，BMI 21～29(23.49±1.53)kg/m2；病程3～14(7.34±2.05)年。同期隨機選擇正在該院隨訪的COPD穩(wěn)定期(SCOPD)患者60例(SCOPD組)，其診斷符合《慢性阻塞性肺疾病診斷、處理和預(yù)防全球策略(2011年修訂版)》[9]，COPD病情穩(wěn)定≥12周且無明確感染。其中，男33例、女27例，年齡38～75(58.61±12.03)歲，BMI 20～29(23.08±1.79)kg/m2，病程2～11(6.59±2.83)年。同期隨機選擇在西寧市第三人民醫(yī)院體檢健康的志愿者60例(對照組)，男38例、女22例，年齡34～77(56.29±12.56)歲，BMI 21～28(23.23±1.64)kg/m2。三組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經(jīng)西寧市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象或其家屬知情同意。

1.2 外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3表達(dá)檢測 AECOPD組于入院次日，SCOPD組和對照組于入院當(dāng)日，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。取血清1 mL置于含1 mL PBS的離心管中，充分混勻后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，然后加入人淋巴細(xì)胞分離液2 mL，2 000 r/min離心15 min，吸取單個核細(xì)胞層置于1.5 mL不含酶的EP管中，再加入適量PBS充分混勻，3 000 r/min離心10 min，洗滌2次后保留沉淀備用。向沉淀中加入TRIzol 1 mL，反復(fù)吹打后室溫靜置5 min，于-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實驗。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按PCR擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：NOD2上游引物5′-CACCCTGACCGTGTCCTGT-3′，下游引物5′-CACCTTGCGG GCATTCTT-3′，擴(kuò)增片段長度159 bp；NLRP3上游引物5′-CTTCCTTTCCAGTTTGCTGC-3′，下游引物5′-TCTCGCAGTCCACTTCCTTT-3′，擴(kuò)片段長度212 bp；GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，擴(kuò)增片段長度197 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL：SYBR Green Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.3 μL，ROX Reference Dyell 0.4 μL，cDNA模板 2 μL，滅菌蒸餾水7 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 60 s、72 ℃ 40 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 外周血炎癥細(xì)胞因子檢測 AECOPD組于入院次日，SCOPD組和對照組于入院當(dāng)日，采集清晨空腹肘靜脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用Elx 800酶標(biāo)儀、ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α，試劑盒由深圳欣博盛生物科技有限公司提供。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 肺功能檢測 所有研究對象采血同日，采用CHESTAC-8900肺功能儀檢測第1秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)，計算FEV1/FVC。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3 mRNA表達(dá)比較 見表1。

表1 各組外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCOPD組比較，#P<0.05。

2.2 各組血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平比較 見表2。

表2 各組血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCOPD組比較，#P<0.05。

2.3 各組FEV1、FVC、FEV1/FVC比較 見表3。

表3 各組FEV1、FVC、FEV1/FVC比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCOPD組比較，#P<0.05。

2.4 AECOPD患者外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3 mRNA表達(dá)與血清炎癥細(xì)胞因子、肺功能相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系 Pearson積矩相關(guān)分析顯示，AECOPD患者外周血單個核細(xì)胞NOD2 mRNA表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.682、0.634、0.701、0.653、0.669，P均<0.05)，與FEV1、FVC、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.722、-0.734、-0.759，P均<0.05)；外周血單個核細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.716、0.672、0.734、0.685、0.671，P均<0.05)，與FEV1、FVC、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.768、-0.725、-0.776，P均<0.05)。

2.5 外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3診斷AECOPD的效能分析 繪制外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3診斷AECOPD的ROC曲線，結(jié)果顯示，外周血單個核細(xì)胞NOD2診斷AECOPD的曲線下面積(AUC)為0.794(95%CI：0.696～0.891)，最佳截斷值為0.34，此時其診斷AECOPD的敏感性為83%、特異性為79%、準(zhǔn)確性為81%；外周血單個核細(xì)胞NLRP3診斷AECOPD的AUC為0.823(95%CI：0.727～0.918)，最佳截斷值為4.97，此時其診斷AECOPD的敏感性為86%、特異性為81%、準(zhǔn)確性為85%；外周血單個核細(xì)胞NOD2聯(lián)合NLRP3診斷AECOPD的AUC為0.914(95%CI：0.856～0.973)，其診斷AECOPD的敏感性為93%、特異性為87%、準(zhǔn)確性為90%。

3 討論

近年來，隨著人口老齡化加劇及環(huán)境污染加重，COPD的發(fā)病率逐年升高，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。煙霧、病原微生物、有害氣體等誘因能夠使COPD病情急性進(jìn)行性加重，繼而進(jìn)展至AECOPD，患者再住院率和病死率較高，預(yù)后較差[10]。因此，尋找敏感性高、特異性強的分子生物標(biāo)志物輔助臨床早期診斷AECOPD，對緩解病情和改善預(yù)后具有重要意義。

迄今為止，AECOPD的發(fā)病機制尚不完全清楚。有研究表明，固有免疫和炎癥反應(yīng)是AECOPD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。病原體的模式識別受體與病原體相關(guān)分子模式通過相互作用使下游信號通路激活，刺激淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等合成并釋放大量炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致固有免疫和炎癥反應(yīng)，而機體能夠通過固有免疫有效清除外源性有害物質(zhì)和病原體等[12]。病原體模式識別受體有NLRs家族、TLRs家族等。NOD2為廣泛存在于人體內(nèi)的NOD蛋白家族成員，在遺傳上具有高度保守性，在免疫和炎癥反應(yīng)過程中能夠發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13]。NOD2在識別病原菌細(xì)胞外壁上的脂多糖和肽聚糖后，在蛋白激酶的作用下結(jié)合特異性配體，激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，介導(dǎo)凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，活化效應(yīng)性Caspase-3，引起細(xì)胞核內(nèi)DNA鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體而死亡，最終清除病原體[14]。有研究還發(fā)現(xiàn)，NOD2激活NF-κB信號通路還可促使NOD2 mRNA過表達(dá)，繼而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子大量釋放[15]。Pranculiene等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NOD2在炎癥性腸病腸黏膜組織中表達(dá)上調(diào)，并可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與疾病過程。NLRP3屬于NLRs家族的炎癥小體，主要由3部分構(gòu)成，分別為NOD樣受體、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和Caspase-1前體，在樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等內(nèi)源性免疫細(xì)胞中廣泛存在[17]。正常生理情況下，NLRP3呈自身抑制狀態(tài)，當(dāng)內(nèi)源性或外源性信號刺激NLRs使其發(fā)生活化并誘導(dǎo)自身寡聚化，可迅速募集凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和Caspase-1前體蛋白，三者聚集并裝配形成炎癥小體，參與調(diào)控炎癥細(xì)胞因子分泌，如IL-1β、IL-18等，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[18]。Cocco等[19]報道，NLRP3在炎癥性腸病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。趙紫琴等[20]研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織NLRP3表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)變化與疾病活動度密切相關(guān)，可作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎一個潛在的治療靶點。但目前關(guān)于NOD2、NLRP3與AECOPD關(guān)系的報道較少。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AECOPD組和SCOPD組外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3表達(dá)均明顯高于對照組，且AECOPD組明顯高于SCOPD組。結(jié)果提示，NOD2、NLRP3能夠參與COPD的發(fā)病過程，且隨著病情加重，二者表達(dá)逐漸升高。在環(huán)境因素中，病原體感染是導(dǎo)致COPD發(fā)病的重要因素。固有免疫是機體對抗病原體入侵的第一道防線，即NOD2通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)炎癥細(xì)胞分泌并釋放大量促炎因子，導(dǎo)致機體固有免疫激活并引起炎癥反應(yīng)。因此，COPD病情越重，固有免疫反應(yīng)越明顯，NOD2表達(dá)越高[21]。NLRP3介導(dǎo)COPD發(fā)病過程可能是因為其發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄因子的作用。當(dāng)病原體入侵時，NOD樣受體識別不同病原體分子模式后激活Caspase-1而促進(jìn)炎癥因子釋放，誘導(dǎo)放大炎癥反應(yīng)，激活固有免疫，進(jìn)而介導(dǎo)COPD氣道損傷和炎癥反應(yīng)過程[22]。IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α是參與炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。這些炎癥細(xì)胞因子能夠通過介導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)參與COPD的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AECOPD組和SCOPD組血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平均高于對照組，且AECOPD組明顯高于SCOPD組，進(jìn)一步證實IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子能夠參與COPD的發(fā)生、發(fā)展。

肺功能是評估COPD病情程度的客觀指標(biāo)，也是臨床制定治療方案的參考依據(jù)之一。本研究結(jié)果顯示，AECOPD組和SCOPD組FEV1、FVC、FEV1/FVC較對照組均明顯降低，且AECOPD組明顯低于SCOPD組，表明COPD病情越嚴(yán)重，患者肺功能越差。Pearson積矩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3 mRNA表達(dá)與血清IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、TNF-α水平均呈正相關(guān)關(guān)系，提示NOD2、NLRP3可能通過其促炎作用參與COPD的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3 mRNA表達(dá)與FEV1、FVC、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示NOD2、NLRP3可作為臨床輔助評估COPD病情程度的重要指標(biāo)。通過繪制ROC曲線評估外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3診斷AECOPD的效能發(fā)現(xiàn)，二者單獨檢測對AECOPD的診斷均具有一定價值，但二者聯(lián)合檢測的診斷價值更高。因此，早期聯(lián)合檢測外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3可輔助診斷AECOPD。

綜上所述，AECOPD患者外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)而促進(jìn)COPD的發(fā)生、發(fā)展。早期聯(lián)合檢測外周血單個核細(xì)胞NOD2、NLRP3可輔助診斷AECOPD。