蔣 俊，莊 平，宋 超，趙 峰，3，周麗青，耿 智，郝長杰，張 濤

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與長江口漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，上海 200090；4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071）

鳳鱭（Coiliamystus）俗稱鳳尾魚、烤籽魚、籽鱭 等，屬 鯡 形 目 （Clupeiformes），鳀 科（Engraulidea），鱭屬，分布于西太平洋的中國、朝鮮半島和日本海域，我國渤海、黃海、東海、南海和臺灣海域均有分布［1-2］。鳳鱭為半溯河洄游性魚類，棲息于沿岸淺水區(qū)或近海，繁殖期集群洄游至河口咸淡水區(qū)域產(chǎn)卵［1］。長江口是鳳鱭重要的產(chǎn)卵場，歷史上鳳鱭曾是長江口“五大漁汛”之一，歷史最高年產(chǎn)量達(dá)3 252 t，占長江口漁業(yè)總產(chǎn)量50%左右。然而由于水體污染、生境破壞、過度捕撈等原因，長江口鳳鱭資源急劇衰退［3］。2009—2011年年均捕撈量僅 100 t左右［3］。目前，已基本不能形成漁汛，資源岌岌可危。

近年來，對鳳鱭的研究多集中在鳳鱭資源［4］、分類［5-6］及繁殖生物學(xué)［7-8］等方面，而對其遺傳學(xué)方面研究較少［9］。作為生物遺傳物質(zhì)信息的主要載體，染色體是生物進(jìn)化的檔案庫［10］?，F(xiàn)有的資料表明，在魚類的種質(zhì)資源、分類進(jìn)化、性別決定等方面的研究中，對魚類染色體的核型進(jìn)行分析具有重要的實際意義，通過核型分析研究方法所得的結(jié)論在魚類遺傳育種方面也是重要的參考資料［11-12］。關(guān)于鳳鱭染色體的核型分析迄今尚未見報道，因此，本研究通過對鳳鱭染色體制作和核型分析來補(bǔ)充鳳鱭的細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，以期為鳳鱭種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳育種和分類學(xué)提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用鳳鱭采自上海臨港近岸海域，為1～2齡的性成熟個體，用于染色體核型分析的10尾（♀5，♂5）鳳鱭，體質(zhì)量分別為（7.52±1.41）g（♀）和（3.70±0.60）g（♂），體長分別為（121.40±7.70）cm（♀）和（101.00±4.36）cm（♂）。樣品采集后放入泡沫箱中暫養(yǎng)20 min，待魚體穩(wěn)定后進(jìn)行實驗，暫養(yǎng)水溫控制在24℃。

1.2 染色體標(biāo)本的制作

參照林義浩［13］和舒虎等［14］的方法，對染色體標(biāo)本制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，方法如下：

1）秋水仙素前處理：采樣現(xiàn)場取鳳鱭鰓絲，放入0.04%秋水仙素溶液（50%過濾當(dāng)?shù)睾Ｋ?50%去離子水）中處理30～45 min。

2）低滲：移除秋水仙素殘液，將鰓絲樣品放入10 mL離心管中，加入0.05 mol·L-1KCl低滲處理50 min。低滲過程中輕輕上下顛倒離心管數(shù)次，使組織細(xì)胞低滲充分。

3）固定：移除低滲液，加入提前預(yù)冷的Carney′s固定液（V甲醇∶V冰醋酸 =3∶1）冰浴固定，每15 min更換一次固定液，重復(fù)3次。

4）解離：將固定后的樣品放入已預(yù)冷的解離液（V冰醋酸∶V蒸餾水=1∶1）中，將鰓絲剪碎，用預(yù)冷的一次性吸管吹散鰓絲上的細(xì)胞，用手指輕彈管壁或?qū)㈦x心管上下顛倒數(shù)次，形成樣品的細(xì)胞懸浮液，最后放入4℃冰箱預(yù)冷。

5）熱滴片：用預(yù)冷的一次性滴管吸取預(yù)冷的解離樣品細(xì)胞懸浮液，從離受熱板1～1.5 m高度的臺面選定3個刻度（相隔2 cm）垂直滴片，滴片后立即平移至受熱板的邊緣，迅速用濾紙吸干，利用受熱板的余溫將細(xì)胞或者染色體貼附，使冰醋酸和蒸餾水揮發(fā)。

6）染色：滴片干燥后，采用10%吉姆薩染液染色30 min，蒸餾水沖洗5～10 s，自然干燥后鏡檢。

1.3 核型計數(shù)及分析

OLYMPUSBX51顯微鏡下對不同雌雄個體的染色體中期分裂相進(jìn)行拍照，平均選取每尾魚12個，共120個分布良好且清晰的分裂相，用Image-Pro Plus 6.0軟件對染色體進(jìn)行計數(shù)。雌雄各選10個具有代表性（分布效果良好、數(shù)目清晰完整、長度適中、著絲點(diǎn)清楚）的中期分裂相進(jìn)行染色體配對和長度測量，根據(jù)LEVAN［15］的標(biāo)準(zhǔn)對染色體進(jìn)行配對、分類、組型排列，計算染色體相對長度（實測單條長度×2/全部染色體長度總和×100%）。采用T檢驗方法，利用SPSS 24軟件對雌雄鳳鱭間及其彼此相鄰的染色體相對長度差異性進(jìn)行顯著性檢驗（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳鱭二倍體染色體數(shù)目

在顯微鏡下，對10尾鳳鱭（♂5，♀5）中平均每尾魚12個中期分裂相染色體（2n），共120個中期分裂相（2n）進(jìn)行計數(shù)、統(tǒng)計（表1）。結(jié)果表明，雄性鳳鱭染色體數(shù)目為48條，占所測60個雄性中期分裂相的71.7%，雌性鳳鱭染色體數(shù)目為47條，占所測60個雌性中期分裂相的75.0%，綜上可以判定雄性鳳鱭的染色體數(shù)目為2n=48，而雌性鳳鱭的染色體數(shù)目為2n=47。

2.2 鳳鱭的染色體核型

通過對鳳鱭雌魚和雄魚各10個良好的中期分裂相進(jìn)行顯微攝像統(tǒng)計分析，得出鳳鱭雌魚和雄魚染色體的相對長度和臂比（表2）。按照LEVEN［15］的標(biāo)準(zhǔn)分析，鳳鱭的染色體組型為t型（染色體全屬于端著絲粒染色體），核型公式為：2n（♂）=48 t，NF=48；2n（♀）=47 t，NF=47。雄性鳳鱭染色體相對長度范圍為（2.66±0.27）～（5.54±0.25），而雌性鳳鱭染色體相對長度范圍為（2.83±0.32）～（5.70±0.38），雌雄鳳鱭的相對長度無顯著差異（P＞0.05），各相鄰兩對染色體之間相對長度無顯著差異（P＞0.05）。

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，對染色體形態(tài)和相對長度進(jìn)行分析，按照相對長度由大到小排列，得到雌雄鳳鱭的染色體中期分裂相（圖1，圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：鳳鱭雄魚的染色體可配對成為24對同源染色體，其染色體數(shù)為48條；而雌魚的染色體只能配對為23對同源染色體，其染色體數(shù)目為47條，有1條染色體無法進(jìn)行配對。

表1 鳳鱭分裂中期染色體數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果Tab.1 Results of the metaphase chromosome number of Coilia mystus

表2 鳳鱭染色體相對長度和臂比值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.2 Relative length and arm ratio of chromosome of Coilia mystus（Mean±SD）

圖1 雌性鳳鱭染色體中期分裂相（左）（×1000），核型圖（右）Fig.1 Metaphase chromosomes（left）（×1000），and karyotype（right）of female Coilia mystus

圖2 雄性鳳鱭染色體中期分裂相（左）（×1000），核型圖（右）Fig.2 Metaphase chromosomes（left）（×1000），and karyotype（right）of male Coilia mystus

3 討論

3.1 鳳鱭染色體制備方法的改進(jìn)

鳳鱭屬于應(yīng)激性特別強(qiáng)的魚類，捕撈出水后存活時間短，其組織細(xì)胞的分裂增生能力會隨著存活時間不斷消減，因此制備鳳鱭染色體標(biāo)本的難度相當(dāng)大。相同屬的刀鱭（C.nasus）和短頜鱭（C.brachygnathus）已有染色體相關(guān)報道，其染色體標(biāo)本制備的主要材料以腎組織為主，其中刀鱭［11］采用了鰓-腎細(xì)胞的植物血球凝集素（PHA）-秋水仙素法制備方法，但其結(jié)果僅表示了腎細(xì)胞，未提及鰓絲細(xì)胞制備效果；短頜鱭［16］則按照腎組織細(xì)胞培養(yǎng)、空氣干燥或火焰干燥法制備標(biāo)本，二者都僅有腎組織細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)，并且步驟繁瑣，前處理所需時間長，不適用于鳳鱭染色體標(biāo)本的制作。

經(jīng)過反復(fù)摸索，本實驗根據(jù)鳳鱭本身的生物學(xué)特性，同時為保持鳳鱭組織細(xì)胞的活力，采用了一種簡單快捷、易于操作的染色體標(biāo)本制備方法。本方法較體內(nèi)注射細(xì)胞法區(qū)別在以下2點(diǎn)：1）采用就近原則，于捕撈現(xiàn)場取樣，當(dāng)場摘取性成熟個體的鰓絲，更好的保持了鳳鱭的組織細(xì)胞活力；2）KCl低滲液濃度為 0.05 mol·L-1，相對于常用的體內(nèi)注射法所需的0.075 mol·L-1KCl低滲液，該濃度低滲處理下的染色中期分裂相多，染色體形態(tài)和分散度好。同時，本實驗也將鰭條作為實驗材料，但發(fā)現(xiàn)鰓絲比鰭條解離細(xì)胞數(shù)多，鰭條不是理想的鳳鱭染色體標(biāo)本制備材料。

此外，實驗存在一些染色體分裂相為非眾數(shù)，這可能與鰓絲細(xì)胞處理、制備標(biāo)本的過程中個別染色體缺失或混雜以及計數(shù)誤差有關(guān)。

3.2 鳳鱭染色體核型分析

性別決定及分化研究是脊椎動物遺傳進(jìn)化研究的重要部分，其研究備受關(guān)注［17］。由于魚類進(jìn)化地位特殊，硬骨魚類的性別決定以及性染色體的研究進(jìn)展較為緩慢。絕大多數(shù)魚類的性別決定機(jī)制原始，除性染色體存在決定性別的基因外，其常染色體有一些基因也參與性別決定［18］。現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，魚類的染色體性別決定主要類型為XX/XY型和ZW/ZZ型，70%的魚類都為這兩種類型：XX/XY為雌性同配 （XX）、雄性異配（XY），ZW/ZZ為雌性異配（ZW）、雄性同配（ZZ）［19］；而少部分魚類為 XX/XO型和 ZO/ZZ型，一種性別的魚中缺失一個性染色體：XX/XO型表現(xiàn)為雄魚缺失一個性染色體，雌性同配（XX），ZO/ZZ型則表現(xiàn)為雌魚缺失一個性染色體，雄性同配（ZZ）［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，雌性鳳鱭染色體數(shù)目為47條，有1條染色體無法進(jìn)行配對，這一現(xiàn)象跟刀鱭［11］與短頜鱭［16］的情況相似：雌魚有一條染色體找不到同源染色體，而雄魚的這一條染色體可以找到同源染色體，因此鳳鱭存在性染色體，其性染色體型為ZO/ZZ型，該類型的性染色體不僅在魚類中較為少見，在脊椎動物中也很罕見。

鳳鱭的染色體組型為t型（染色體全屬于端著絲粒染色體），在形態(tài)上觀察不到明顯的區(qū)別。本研究對雌雄鳳鱭的染色體相對長度進(jìn)行了對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不存在顯著差異（P＞0.05），從大到小呈連續(xù)遞減的趨勢，這與半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）［20］雌雄染色體對比的結(jié)果不同，這一現(xiàn)象可能跟鳳鱭和半滑舌鰨的性染色體類型不同有關(guān)，半滑舌鰨性染色體類型屬于ZW/ZZ型。通過這一發(fā)現(xiàn)可以推斷出：同為t型的ZO/ZZ型與ZW/ZZ型兩種類型的魚類性染色體不光數(shù)目上存在差異，在其雌雄魚的相對長度對比上也有區(qū)別。

根據(jù)日本學(xué)者小島吉雄［21］對魚類染色體3種演化類群的描述發(fā)現(xiàn)，真骨魚類可劃分為3種演化類群：低位、中位和高位，魚類的演化類群進(jìn)化越高，其染色體數(shù)目分布越收斂，端部著絲粒染色體多，臂數(shù)少。而本研究發(fā)現(xiàn)，鳳鱭全部染色體均為端部著絲粒染色體，其染色體數(shù)目極為收斂，且臂數(shù)為47～48，按照上述劃分，應(yīng)屬于高位演化類群，但鳳鱭在真骨魚類中卻屬于低位演化類群，同屬的刀鱭和短頜鱭的染色體分布和端部著絲粒也同鳳鱭類似［11，16］，鱭屬魚類在魚類演變進(jìn)化過程中是否存在高位和低位之分有待進(jìn)一步研究。此外，李樹深［22］根據(jù)染色體的著絲粒染色體位置把魚類分為兩種類群：原始類群，具有較多端部著絲粒染色體；特化類群，具有較多中部或亞中部著絲粒染色體，并且特化類群還分為臂數(shù)少的較特化類群和臂數(shù)多的特化類群。據(jù)此本研究更傾向于鳳鱭屬于原始類群，在真骨魚類中是非常原始的。另外，鳳鱭的性染色體特別明顯，本身卻很原始，結(jié)合相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)魚類性染色體的發(fā)生及其演化過程和它們的系統(tǒng)演化之間并不存在平行關(guān)系［9，21］。綜上所述，雖然魚類在脊椎動物中進(jìn)化位置最為原始，但由于魚類在脊椎動物的系統(tǒng)演化過程中處于承前啟后的關(guān)鍵地位，演化歷史久遠(yuǎn)，分支繁多，使得在魚類生命進(jìn)化歷程中會表現(xiàn)出各種不同染色體類型和最為復(fù)雜的性別決定機(jī)制。

我國鱭屬魚類有鳳鱭、刀鱭、七絲鱭（C.grayii）和發(fā)光鱭（C.dussumieri）4種，其外部形態(tài)和生態(tài)習(xí)性均較為相似［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，鳳鱭的染色體核型公式為 2n（♂）=48 t，NF=48；2n（♀）=47 t，NF=47，與刀鱭和短頜鱭的研究結(jié)果相同［11，16］，這一發(fā)現(xiàn)從遺傳細(xì)胞學(xué)的角度解釋了這3種魚類的親緣關(guān)系十分密切，ZO/ZZ型性染色體應(yīng)為鱭屬魚類的普遍現(xiàn)象。

4 小結(jié)

本研究通過活體取鰓制染色體標(biāo)本技術(shù)制備了鳳鱭染色體標(biāo)本，并對其核型進(jìn)行了分析，其雌性染色體數(shù)目為2n=47，雄性染色體數(shù)目為2n=48；核型公式為 2n（♀）=47t，2n（♂）=48t；雌性染色體臂數(shù)（NF）=47，雄性NF=48。鳳鱭存在性染色體，其性染色體類型為ZO/ZZ型，這與刀鱭［11］和短頜鱭［16］的研究結(jié)果相同。此結(jié)果補(bǔ)充了細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)和鳳鱭的種質(zhì)檢驗參考數(shù)據(jù)，從染色體水平為鱭屬魚類的分類與進(jìn)化角度提供了數(shù)據(jù)資料。此外，唐文喬等［23］研究表明，短頜鱭為刀鱭的陸封種群，關(guān)于兩者染色體核型的研究結(jié)果顯示，刀鱭和短頜鱭染色體數(shù)目和核型均一致［11，16］。張世義［2］認(rèn)為我國鳳鱭至少有3個地方種群，即長江型、閩江型和珠江型，其體型及顏色具有較大的差異，且長江型與閩江型［5，9］及珠江型［11］群體間的分化均已達(dá)亞種水平。本研究的鳳鱭采自長江口，屬長江型，3個鳳鱭地方種群的染色體核型間是否存在差異還有待進(jìn)一步的研究。