熊大林，段亞飛，王 蕓，張家松，陳成勛，董宏標(biāo)，李 華，劉青松

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300）

凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）又稱南美白對蝦，是我國重要的海水養(yǎng)殖蝦類［1］。然而，在對蝦集約化養(yǎng)殖模式中，養(yǎng)殖密度過高導(dǎo)致環(huán)境脅迫增加、病害頻發(fā)，對蝦死亡率居高不下。養(yǎng)殖病害是病原、環(huán)境和動物之間互作的結(jié)果，其中環(huán)境脅迫是主要的誘導(dǎo)因素［2］。氨氮是對蝦養(yǎng)殖中主要的環(huán)境脅迫因子，其主要是由對蝦殘餌、排泄物等含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生［3］。研究表明，高濃度的氨氮脅迫會造成對蝦抗病力降低、免疫力下降和病原易感性增加等，危害對蝦的存活和生長［4-6］。

近年來，對蝦腸道炎癥問題廣受關(guān)注。腸道是對蝦營養(yǎng)和免疫的主要器官組織，其作為動物消化道的主要屏障，能夠分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)，阻止病原微生物入侵機(jī)體［7］。此外，對蝦腸道內(nèi)棲息著大量的微生物菌群尤其是病原微生物，其同樣富含于對蝦養(yǎng)殖水環(huán)境中［8］。因此，對蝦腸道組織受到內(nèi)外環(huán)境的雙重影響，極易遭受環(huán)境脅迫而導(dǎo)致黏膜組織損傷和免疫功能紊亂，增加病原入侵機(jī)體的風(fēng)險(xiǎn)［9-10］。然而，作為對蝦高密度養(yǎng)殖條件下主要的水質(zhì)脅迫因子——氨氮，其對養(yǎng)殖對蝦腸道免疫功能影響的研究尚未見報(bào)道。

對蝦缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠非特異性免疫因子抵抗病原感染和環(huán)境脅迫。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）是動物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶［11］。溶菌酶（Lys）和酚氧化酶原（proPO）可作為衡量對蝦抗病原感染的功能指標(biāo)［11-12］?？寡趸溉绯趸锲缁福⊿OD）和熱休克蛋白（HSPs）具有清除生物體內(nèi)活性氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的功能［9］。因此，本研究通過測定急性氨氮脅迫下凡納濱對蝦腸道這幾種免疫生化指標(biāo)和基因表達(dá)量變化，旨在探討對蝦腸道組織應(yīng)答氨氮脅迫的免疫學(xué)特征，篩選其相關(guān)評價(jià)指標(biāo)，以期為其腸道健康研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用健康凡納濱對蝦取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，平均體質(zhì)量（5.4±0.3）g；于500 L玻璃纖維桶中暫養(yǎng)7 d，每桶50尾。實(shí)驗(yàn)期間，水溫30℃，鹽度30，pH 8.3，不間斷充氣，每天換水1/3，并投喂對蝦配合飼料。

1.2 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)

將暫養(yǎng)7 d的對蝦隨機(jī)分為兩組，即：對照組和氨氮脅迫組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行50尾蝦。氨氮脅迫組的水體氨氮含量設(shè)定為20 mg·L-1，使用10 g·L-1的NH4Cl進(jìn)行調(diào)節(jié)；每4 h使用靛酚藍(lán)分光光度法（GB 17378.4-2007）檢測水中氨氮濃度，并用NH4Cl溶液進(jìn)行調(diào)整；每天換水1/3，并加入相應(yīng)氨氮濃度的養(yǎng)殖海水。對照組實(shí)驗(yàn)和暫養(yǎng)期間的養(yǎng)殖條件一致。分別于脅迫后的0、6、12、24、48和72 h，取對蝦中腸于液氮中冷凍保存。同一時(shí)間點(diǎn)每個(gè)平行組分別取6尾蝦的中腸，用鑷子輕輕刮去腸道內(nèi)容物，分別使用3尾用于生化指標(biāo)和基因表達(dá)分析。

1.3 生化指標(biāo)測定

使用預(yù)冷的0.86%生理鹽水對所取的腸道組織進(jìn)行漂洗，去除組織液，濾紙拭干，稱重后置于離心管中。按照m（組織，g）∶V（生理鹽水，mL）=1∶9加入預(yù)冷的0.86%生理鹽水，超聲粉碎制備組織勻漿液；然后于4℃、3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于-80℃保存，用于生化指標(biāo)測定。

使用南京建成生物工程研究所試劑盒分別測定 ACP、ALP、Lys、T-AOC和 SOD活性，以及組織蛋白含量，相關(guān)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。各項(xiàng)指標(biāo)測定所用試劑盒均為同批次試劑?？偟鞍缀康臏y定采用考馬斯亮藍(lán)法。ACP活性測定采用磷酸苯二鈉法，以1 g組織蛋白與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位；ALP活性測定采用磷酸苯二鈉法，以1 g組織蛋白與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位；Lys活性測定采用比濁法；1 mg組織蛋白與基質(zhì)作用1 min使反應(yīng)體系的吸光度（OD）值增加0.01為1個(gè)T-AOC單位；SOD活性采用羥胺法，以1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的 SOD量為1個(gè)酶活力單位（U·mg-1）。

1.4 免疫基因表達(dá)分析

使用Trizol試劑提取氨氮脅迫后各時(shí)間點(diǎn)對蝦腸道組織的總 RNA；使用核酸定量儀（ThermoFisher，USA）檢測其純度和濃度，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量及完整性。使用DNaseⅠ去除總RNA中多余的DNA，使用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃下備用，具體操作按照說明書進(jìn)行。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的凡納濱對蝦熱休克蛋白70（HSP70）、熱休克蛋白 90（HSP90）、酚氧化酶原（proPO）基因和內(nèi)參基因β-actin的cDNA序列，使用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)正反特異性引物（表1），利用Real-time PCR對各組上述幾種基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品3個(gè)平行，按照 SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa，Beijing）試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL SYBR Premix ExTaqTMⅡ （2×），0.8 μL 10μmol·L-1正向引物，0.8μL 10μmol·L-1反向引物，0.4μL ROX Reference DyeⅡ （50×），2.0μL cDNA，6.0μL DEPC水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮脅迫對凡納濱對蝦腸道免疫酶活性的影響

與對照組相比，氨氮脅迫6 h，對蝦腸道ACP活性顯著升高（P＜0.05）；隨后逐漸降低，并于24～72 h顯著低于對照組（P＜0.05）（圖1-A）。ALP活性于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），并于12 h達(dá)到最大值；隨后于48 h和72 h逐漸降低至顯著低于對照組（P＜0.05）（圖1-B）。Lys活性于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），隨后逐漸升高，并于24 h達(dá)到最大值；氨氮脅迫72 h，Lys活性顯著低于對照組（P＜0.05）（圖1-C）。

表1 本研究所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

2.2 氨氮脅迫對凡納濱對蝦腸道抗氧化酶活性的影響

與對照組相比，對蝦腸道T-AOC活性于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），并于12 h達(dá)到最大值；隨后于48 h和72 h顯著降低（P＜0.05），并低于對照組水平（圖2-A）。SOD活性于氨氮脅迫6 h顯著升高至最大值（P＜0.05），隨后逐漸降低，并于48 h和72 h顯著低于對照組（P＜0.05）（圖2-B）。

2.3 氨氮脅迫對凡納濱對蝦腸道免疫基因表達(dá)的影響

與對照組相比，氨氮脅迫 6 h，對蝦腸道HSP70基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），并于24 h達(dá)到最大值；隨后表達(dá)水平雖有降低，但仍顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3-A）。HSP90基因表達(dá)水平于氨氮脅迫后12 h顯著升高至最大值（P＜0.05），隨后逐漸降低，并于48 h和72 h達(dá)到對照組水平（圖3-B）。proPO基因表達(dá)水平于氨氮脅迫6 h顯著升高（P＜0.05），并于12 h達(dá)到最大值；隨后表達(dá)水平逐漸降低，并于72 h達(dá)到對照組水平（圖3-C）。

圖1 氨氮脅迫對凡納濱對蝦腸道免疫酶活性的影響Fig.1 Immune enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

圖2 氨氮脅迫對凡納濱對蝦腸道抗氧化酶活性的影響Fig.2 Antioxidant enzyme activities in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

圖3 氨氮脅迫對凡納濱對蝦腸道免疫基因表達(dá)的影響Fig.3 Immune gene expression in intestines of L.vannamei under ammonia-N stress

3 討論

對蝦主要依賴其非特異性免疫系統(tǒng)來抵御環(huán)境脅迫。研究表明，環(huán)境脅迫能夠損傷對蝦腸道黏膜組織，破壞腸道菌群的穩(wěn)定性，給條件致病菌創(chuàng)造入侵宿主機(jī)體的機(jī)會［9-10，12-13］。例如，凡納濱對蝦分別被氨氮和亞硝酸鹽脅迫72 h，腸道黏膜上皮細(xì)胞受損、脫落，黏液蛋白基因表達(dá)量紊亂，菌群多樣性降低、條件致病菌豐度增加［13］。此外，硫化物、脂多糖也會導(dǎo)致凡納濱對蝦腸道屏障功能受損［9-10，12］。因此，研究環(huán)境脅迫下對蝦腸道抗病原感染、抗氧化等免疫功能指標(biāo)變化，可以為其腸道損傷保護(hù)研究提供理論參考。

ACP和ALP是兩種重要的溶酶體酶，屬于磷酸單酯水解酶類，其活性常用作蝦類非特異免疫功能的評價(jià)指標(biāo)［14］。Lys作為對蝦機(jī)體中重要的抗菌蛋白，可以裂解細(xì)菌細(xì)胞，是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)［15］。proPO系統(tǒng)可以識別革蘭氏陰性菌的脂多糖、真菌的β-1，3-葡聚糖和革蘭氏陽性菌的肽聚糖等，是蝦類機(jī)體識別“非己”成分的免疫系統(tǒng)［16-17］。艾春香等［18］研究表明，氨氮脅迫導(dǎo)致擬穴青蟹（Scyllaparamamosain）鰓和肝胰腺中ACP和AKP活性顯著下降。岳峰等［19］研究表明，氨氮脅迫導(dǎo)致三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血細(xì)胞proPO活性和溶菌活力顯著下降。本研究中，凡納濱對蝦被氨氮脅迫6 h和12 h，腸道ACP、ALP和Lys活性以及proPO基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），表明機(jī)體合成大量抗菌蛋白用于應(yīng)對氨氮脅迫的毒性作用；但是，氨氮脅迫72 h，ACP、ALP和 Lys活性顯著下降，表明氨氮脅迫對對蝦非特異性免疫功能造成了損傷，降低了其抗病原感染能力。

當(dāng)動物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，機(jī)體會產(chǎn)生過量的活性氧（ROS），導(dǎo)致氧化損傷［20］。為維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，蝦類體內(nèi)形成抗氧化防御系統(tǒng)包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，而其功能狀況可以用T-AOC來衡量［11］。SOD在機(jī)體清除超氧陰離子（·O2-）過程中首先被誘導(dǎo)，可將·O2-分解為H2O2和 O2，是抗氧化酶系統(tǒng)的標(biāo)志酶［9］。王蕓等［4］研究表明，中 國 明對蝦 （Fenneropenaeus chinensis）被 8 mg·L-1氨氮脅迫后6 h，其血淋巴中T-AOC活性顯著升高，隨后逐漸降低。任海等［21］研究表明，在不同濃度氨氮脅迫下，脊尾白蝦（Exopalaemoncarinicauda）血淋巴和肝胰腺中SOD活性隨氨氮濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長，呈先上升后下降的趨勢。本研究中，氨氮脅迫6 h，凡納濱對蝦腸道T-AOC活性顯著升高（P＜0.05），且SOD活性達(dá)到最大值，表明對蝦腸道抗氧化酶系統(tǒng)被激活用于清除機(jī)體集聚的ROS；但是氨氮脅迫48 h和72 h，T-AOC和SOD活性均顯著降低，表明氨氮脅迫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了過量ROS，超過了抗氧化酶的調(diào)節(jié)閾值，導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)受損。

熱休克蛋白如HSP70和HSP90等，是生物體內(nèi)主要的應(yīng)激蛋白，其主要以“分子伴侶”形式修復(fù)機(jī)體受損的組織蛋白，在細(xì)胞保護(hù)、抗氧化等方面具有很重要作用［22］。HSPs表達(dá)量增加可以用于機(jī)體抵抗環(huán)境脅迫，提高動物的抗應(yīng)激能力［23］。研究表明，機(jī)體HSP70與SOD基因的表達(dá)水平相一致，且HSP70直接增加機(jī)體內(nèi)源性過氧化物酶活性，用于降解 ROS［24］。王蕓等［25］研究表明，中國對蝦在氨氮脅迫下6～24 h，其機(jī)體HSP90基因表達(dá)量顯著上調(diào)，隨后下降。本研究中，凡納濱對蝦腸道HSP70基因表達(dá)水平在氨氮脅迫72 h內(nèi)均顯著高于對照組（P＜0.05），表明HSP70在對蝦腸道組織抵御氨氮脅迫進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。而HSP90基因在氨氮脅迫6～12 h顯著升高（P＜0.05），隨后逐漸降至對照組水平，其與中國對蝦的研究結(jié)果相似，表明長時(shí)間的氨氮脅迫造成腸道免疫功能受到抑制，從而導(dǎo)致HSP90基因表達(dá)水平下降。

4 小結(jié)

20 mg·L-1氨氮急性脅迫凡納濱對蝦72 h，對蝦腸道抗病原感染指標(biāo)（ACP、ALP、Lys和proPO），以及抗氧化功能指標(biāo)（T-AOC、SOD、HSP70、HSP90）發(fā)生顯著變化，表明氨氮脅迫造成對蝦腸道免疫功能紊亂。本研究所選的幾種免疫指標(biāo)對氨氮脅迫的反應(yīng)均較為敏感，可以作為對蝦腸道免疫損傷保護(hù)研究的評價(jià)指標(biāo)。