趙宇豪 薛楊繼 丁豪杰 丁建祖 鄭 斌 卓洵輝 樓 滌 陳 睿 孔慶明 陸紹紅

(杭州醫(yī)學(xué)院寄生蟲病研究所，杭州 310013)

剛地弓形蟲Toxoplasmagondii，是一種廣泛分布的機(jī)會性致病原蟲，其感染已成為嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問題(Limetal., 2012; Tianetal., 2012; Andiappanetal., 2014; Heddergottetal., 2018)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上約有三分之一的人口弓形蟲抗體呈陽性(Robert-Gangneuxetal., 2012)。弓形蟲感染可使孕婦流產(chǎn)、死產(chǎn)，影響胎兒發(fā)育、嚴(yán)重致畸甚至死亡(Bladeretal., 2015)。目前，弓形蟲的診斷已列為我國孕婦優(yōu)生五項(xiàng)(TORCH)檢測指標(biāo)之一。另外，弓形蟲感染與多種惡性腫瘤以及神經(jīng)精神疾病的發(fā)生相關(guān)，對人類健康造成較大威脅(Bladeretal., 2015)。弓形蟲循環(huán)抗原(Circulating antigen, CAg)檢測能反映感染蟲荷，是早期、現(xiàn)癥感染和療效考核的指標(biāo)(Wangetal., 2016)。然而，由于一般患者體內(nèi)CAg的含量非常低，尤其在感染2周后，CAg含量會快速下降至低水平(Lykinsetal., 2018)，常規(guī)CAg檢測方法對于輕度和慢性患者的檢出率低、特異性差，無法滿足需求(Liuetal., 2015; Gashoutetal., 2016; Rahimi-Esboeietal., 2018)。弓形蟲表面抗原蛋白1(Surface antigen 1, SAG1)是CAg中的主要成分，與蟲體的入侵與毒力密切相關(guān)(Khanalihaetal., 2014; Abdizadehetal., 2015)。

駱駝體內(nèi)存在一種天然輕鏈缺失的功能性重鏈抗體(Heavy chain antibodies，HCAb)，克隆該重鏈抗體的可變區(qū)得到最小的抗原結(jié)合片段，即納米抗體(Nanobody，Nb)(Hamers-Castermanetal., 1993)(圖1)。納米抗體相較于普通抗體，具有體積小、溶解度高、穩(wěn)定性好、體內(nèi)組織滲透性好等優(yōu)點(diǎn)(Kunzetal., 2018)，其分子量只有15 kDa左右，不足傳統(tǒng)抗體(160 kDa)的十分之一，并且很容易通過基因工程技術(shù)獲得(Bannasetal., 2017)。納米抗體在抗原結(jié)合界面上具有獨(dú)特的靈活性，能結(jié)合到普通抗體無法觸及的抗原表位，較小個體使其能夠以高密度牢固地結(jié)合于固相載體捕捉微量抗原，提高了檢測敏感度，具有現(xiàn)癥感染和早期診斷價(jià)值，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景(De Meyeretal., 2014; Salvadoretal., 2019)。本研究擬構(gòu)建弓形蟲RH株SAG1蛋白的納米抗體庫，淘選并鑒定SAG1特異的納米抗體，為弓形蟲感染的早期檢測試劑研制奠定基礎(chǔ)。

圖1 納米抗體示意圖

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1蟲株、菌株與質(zhì)粒: 剛地弓形蟲RH株、菌株E.coliBL21(DE3)、TG1、WK6和載體pET-28a、pHEN4、pMECS均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑: Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及DNA marker購自Takara 寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒小劑量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，蛋白Marker、IPTG、Ni-NTA購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 納米抗體文庫構(gòu)建引物列表

1.2 弓形蟲SAG1抗原的制備

根據(jù)NCBI上獲得的弓形蟲RH蟲株的SAG1基因序列(HM776940.1)設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增基因序列得到片段大小約為780 bp的SAG1目的基因片段，連接pMD19-simple質(zhì)粒并測序。將測序正確的序列和pET-28a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。將測序正確的陽性克隆接種于2YT (100 μ/mL Ampicillin，2% Glucose)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為0.6，加入IPTG(1 mmol/L)進(jìn)行原核表達(dá)，將表達(dá)過夜的菌液超聲破裂菌體，并以8 mol/L尿素溶解包涵體，離心后，收集上清。SDS-PAGE鑒定后Ni-NTA柱純化獲得重組SAG1(Recombinant SAG1, rSAG1)。

1.3 駱駝免疫及淋巴細(xì)胞的分離

將600 μL rSAG1蛋白(1 mg/mL)與弗氏佐劑等體積混合，乳化后頸部皮下注射免疫一只雙峰駝Camelusbactrianus，觀察注射后包塊的吸收狀況，以確保免疫效果。初次免疫后每隔兩周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，連續(xù)3～5次免疫后采血，ELISA檢測血清中抗體效價(jià)。效價(jià)合格后頸靜脈取400 mL抗凝血，密度梯度離心法純化外周血中淋巴單核細(xì)胞。

1.4 駱駝免疫抗體文庫的構(gòu)建

使用TRIzol LS Reagent 提取單核細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)與量。反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，以cDNA為模板通過巢式PCR進(jìn)行VHH片段的擴(kuò)增。限制性內(nèi)切酶對巢式PCR的終產(chǎn)物和噬菌粒載體pHEN4進(jìn)行雙酶切鑒定，按照目的片段與載體的分子摩爾比3∶1在16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化TG1，在輔助噬菌體的作用下形成噬菌體納米抗體文庫，PCR(引物序列見表1)鑒定陽性率并計(jì)算抗體庫容。

1.5 噬菌體的擴(kuò)增與分離

取凍存在-80℃中的VHH納米抗體庫TG1菌液，接種至100 mL的YT培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃的條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.45左右，加入1012的輔助噬菌體M13K07，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置30 min使噬菌體感染TG1菌，靜置后4 000 r/min、4℃離心10 min，并將沉淀于300 mL的YT培養(yǎng)基中重懸，37℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的菌液8 000 r/min、4℃離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中加入1/6的PEG 8000/NaCl溶液，混勻后冰浴30 min。4 000 r/min、4℃離心30 min后，棄上清，將所得的噬菌體用1 mL PBS溶解，13 000 r/min短暫離心5 min后4℃保存。

1.6 抗SAG1納米抗體文庫的淘選

將rSAG1蛋白稀釋至30 μg/mL，加入96孔ELISA板中，每孔100 μL，4℃包被過夜。使用含有2% BSA的PBS緩沖液37℃封閉1.5 h。每孔加入100 μL滴度為 2.0×1011cfu/mL的噬菌體展示文庫，37℃孵育2 h，使用PBST洗板20次以去除非特異性結(jié)合的噬菌體。每孔加入100 μL Gly-HCl(pH 2.2)洗脫液洗脫噬菌體，反復(fù)吹打10 min，調(diào)節(jié)pH至最終為7.0。加入10 mL處于對數(shù)期生長的TG1菌和洗脫產(chǎn)物，于37℃中靜置感染30 min。分別取20、40、60、80、100 μL菌液涂布于2YT固體培養(yǎng)基中，計(jì)算菌落數(shù)，按每毫升所含的克隆數(shù)目計(jì)算滴度。4 000 r/min離心剩余的菌液，使其重懸于2YT培養(yǎng)基中并加入200 μL/mL的甘油，混合均勻后保存于-20℃以備下一輪淘選。第2輪淘選包被濃度為5 μg/mL的SAG1蛋白，同時(shí)設(shè)置未包被蛋白的陰性對照。

1.7 抗SAG1納米抗體的phage-ELISA以及序列多態(tài)性分析

從上述淘選后的噬菌體平板中隨機(jī)挑選60個噬菌體進(jìn)行phage-ELISA，并從phage-ELISA結(jié)果中挑選抗原結(jié)合能力強(qiáng)的陽性克隆株進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行陽性克隆株VHH序列多態(tài)性分析。

表2 抗SAG1納米抗體引物

1.8 抗SAG1 VHH納米抗體的原核表達(dá)、純化和Western-blot鑒定

根據(jù)篩選后測序獲得的抗SAG1納米抗體(Anti-SAG1-Nb)基因序列設(shè)計(jì)引物(表2)，擴(kuò)增出納米抗體基因片段后連接至表達(dá)載體pMECS并測序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的重組載體pMECS-Nb電轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株WK6中，以TB培養(yǎng)基(100 μg/mL Ampicillin，0.1% Glucose，2 mmol/L MgCl2)，37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600于0.6～0.9，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，28℃培養(yǎng)16 h。隨后，4℃、4 000 r/min離心10 min收集菌液并以滲透壓變化法裂解菌體，收集上清，以Ni-NTA純化Anti-SAG1-Nb，收集純化后的納米抗體-20℃保存。

將1.2制備的rSAG1稀釋至0.4 mg/mL，SDS-PAGE電泳后以純化獲得的8個Anti-SAG1-Nb系列納米抗體為一抗(稀釋至終濃度5 μg/mL)，HRP抗HA標(biāo)簽鼠單抗IgG(CWbio)作為二抗(終濃度為：3 μg/mL)，進(jìn)行Western-Blot檢測，設(shè)置陰性對照為弓形蟲MIC重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，一抗為Nb-Anti-SAG1-Nb-5二抗?jié)舛韧希魂栃詫φ詹捎米灾苧SAG1(0.4 mg/mL)上樣后以抗SAG1單抗(Thermo Fisher)作為一抗(稀釋比例為1∶10， 終濃度為10 μg /mL)，HRP羊抗鼠IgG(CWbio)作為二抗(濃度稀釋至3 μg/mL)。

弓形蟲感染小鼠7 d后收集腹水，純化獲得弓形蟲天然膜抗原以及胞質(zhì)抗原，將膜抗原、胞質(zhì)抗原以及rSAG1重組抗原稀釋至1 mg/mL，SDS-PAGE凝膠電泳后，以納米抗體Nb-SAG1-5為一抗(稀釋至終濃度為5 μg/mL)，HRP抗HA標(biāo)簽鼠單抗IgG(CWbio)作為二抗(濃度同上)，進(jìn)行Western-Blot檢測。

1.9 抗SAG1納米抗體親和性測定分析

制備好的rSAG1抗原稀釋后進(jìn)行生物素標(biāo)記。用脫鹽柱脫去未結(jié)合的生物素后，將SA傳感器末端潤濕后置于處理好的上述SAG1抗原中進(jìn)行固化。將待測抗SAG1納米抗體用PBS稀釋至濃度為6.25、12.5、25、50、100 nmol/L，每組樣品總體積200 μL。將稀釋后的待測納米抗體樣品和空白對照置于96孔板中，采用ForteBio Octet Red 生物分子互作儀對待檢樣品進(jìn)行檢測。利用Octet數(shù)據(jù)分析軟件CFR Part 11 Version 6.x對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，經(jīng)過數(shù)據(jù)擬合后得到納米抗體的結(jié)合常數(shù)Kon值、解離常數(shù)Kdis值以及親和常數(shù)KD值。

2 結(jié)果

2.1 SAG1噬菌體納米抗體免疫文庫的構(gòu)建

弓形蟲rSAG1抗原表達(dá)純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定，蛋白分子量約為28 kDa。以rSAG1免疫駱駝，第4次免疫后檢測效價(jià)，結(jié)果顯示抗血清稀釋比為1∶51 200時(shí)，OD490為0.2左右(P/N≥2.1)，符合建庫要求。巢式PCR擴(kuò)增獲得大小約400 bp的VHH目的片段(圖2-A)。平板計(jì)數(shù)測得文庫庫容為3.6×109cfu/mL，滴度為1.99×1013pfu/mL。為鑒定VHH基因的插入率，隨機(jī)挑選20個單菌落并PCR鑒定，(圖2-B-1/2)有18個擴(kuò)增出大小約為500～750 bp目的條帶，由此推斷陽性率為90%。因此，構(gòu)建的噬菌體展示文庫實(shí)際庫容為3.24×109cfu/mL。

表3 各輪淘選噬菌體滴度和富集度

表4 陽性克隆phage-ELISA結(jié)果

圖2 SAG1噬菌體展示納米抗體免疫文庫的構(gòu)建

2.2 特異性納米抗體庫的淘選與鑒定

使用rSAG1淘選后，特異性噬菌體得到有效富集,富集度達(dá)到3.75×103(表3)。隨機(jī)挑選40個陽性克隆進(jìn)行測序，將基因序列翻譯成氨基酸序列并進(jìn)行Blast比對，超變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3序列相同的株視為同一克隆株，結(jié)合噬菌體ELISA結(jié)果，1、2、5、7、14、15、38、40號8個代表克隆株歸屬為3個不同分支(圖3)，其中1、5、15號3個克隆株與抗原結(jié)合能力較強(qiáng)(表4)。

圖3 抗SAG1納米抗體同源性比對分析

2.3 抗弓形蟲SAG1系列納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)、純化以及Western-blot鑒定

將以上8個陽性克隆的VHH基因亞克隆至表達(dá)載體pMECS，誘導(dǎo)表達(dá)純化后SDS-PAGE鑒定分子量大小與純度，以Nb-SAG1-5為例(圖4-A)，所得抗SAG1系列納米抗體大小約為17 kDa。Western-blot鑒定結(jié)果表明以上表達(dá)的8個納米抗體均可與重組蛋白rSAG1發(fā)生反應(yīng)(圖4-B-1/2)，其中Nb-SAG1-5、Nb-SAG1-14、Nb-SAG1-38以及Nb-SAG1-40對于rSAG1的WB結(jié)果較其他4個抗體均有更明顯且單一的條帶。后續(xù)采用剛地弓形蟲RH株免疫小鼠后獲得的天然膜抗原以及胞質(zhì)抗原進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：Nb-SAG1-5能夠與弓形蟲免疫小鼠獲得的天然抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生明顯且單一的目的條帶(圖4-C)。

2.4 抗SAG1納米抗體Nb-SAG1-5的親和力測定

采用生物膜干涉技術(shù)對表達(dá)的Nb-SAG1-5納米抗體進(jìn)行親和力檢測，利用Octet數(shù)據(jù)分析軟件CFR Part 11 Version 6.x 對結(jié)合動力學(xué)結(jié)果數(shù)據(jù)擬合獲得Anti-SAG1-Nb-5的結(jié)合常數(shù)Kon值、解離常數(shù)Kdis值以及親和常數(shù)KD值。其中，Anti-SAG1-Nb-5與rSAG1的KD值為1.66 nmol/L。

圖4 抗弓形蟲SAG1納米抗體的表達(dá)、純化以及Western-blot鑒定

3 討論

近年來，新型基因工程抗體不斷出現(xiàn)，抗體小型化是抗體基因工程的主要研究方向之一(Robert-Gangneuxetal., 2012; Bannasetal., 2017; Salvadoretal., 2019)。納米抗體是克隆駱駝體內(nèi)功能性重鏈抗體的可變區(qū)得到的最小抗原結(jié)合片段，具有常規(guī)單域抗體無法比擬的水溶性和構(gòu)象穩(wěn)定性，能高特異性、高親和力地結(jié)合抗原。納米抗體能夠以高密度牢固地結(jié)合于固相載體捕捉微量抗原，已用于前列腺特異膜抗原(Zareetal., 2014; Hassanietal., 2019)、中毒性休克綜合征毒素-1(Adamsetal., 2009; Kongetal., 2014;)等在臨床體外檢測中較難檢出的靶點(diǎn)、毒素等。在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域，關(guān)于錐蟲(Odongoetal., 2016; Stijlemansetal., 2017; Pinto Torresetal., 2018)、犬弓蛔蟲(Morales-Yanezetal., 2019a; Morales-Yanezetal., 2019b)、日本血吸蟲(鄭斌等，2016; 丁豪杰等，2017)等相關(guān)的納米抗體制備與應(yīng)用也已有報(bào)道。

本研究首次成功構(gòu)建了弓形蟲SAG1納米抗體噬菌體文庫，其實(shí)際庫容約為3.24×109cfu/mL，與已報(bào)到的納米抗體文庫數(shù)據(jù)比較后證實(shí)具有較高的庫容(Xuetal., 2018; Bannasetal., 2017)。本研究首次成功構(gòu)建了弓形蟲SAG1的納米抗體文庫，淘選制備了8個抗弓形蟲SAG1納米抗體，分子量為17 kDa左右，大小約為分子量為30 kDa的單鏈抗體(scFv)的1/2，并且易表達(dá)，經(jīng)NI-NTA親和層次和AKTA系統(tǒng)純化產(chǎn)量可達(dá)到5～10 mg/mL。本研究中所篩選獲得的納米抗體均能與重組SAG1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，其中Anti-SAG1-Nb-5能夠與小鼠免疫弓形蟲RH株后提純獲得的天然抗原特異性反應(yīng)，且Anti-SAG1-Nb-5與弓形蟲rSAG1重組抗原親和常數(shù)為1.66×10-9mol/L，達(dá)到納摩爾級的親和力。與已報(bào)道的納米抗體親和常數(shù)(10-7～10-8mol/L)(孫慶明等, 2014; 李日飛等, 2018)比較后證實(shí)，本研究所制備的納米抗體Anti-SAG1-Nb-5與抗原的結(jié)合活性較高。分析認(rèn)為，在本研究免疫駱駝與淘選文庫的過程中使用的是原核表達(dá)的SAG1，其構(gòu)象與天然SAG1存在差異，故針對篩選出來的納米抗體個數(shù)較少且部分納米抗體無法與弓形蟲天然抗原特異性識別的問題，后期可以嘗試真核表達(dá)系統(tǒng)制備SAG1進(jìn)行駱駝免疫和納米抗體文庫的淘選，或通過構(gòu)建雙價(jià)或多價(jià)的納米抗體以提升其親和力(Beirnaertetal., 2017; Sadeghietal., 2019)，有望找到更多高親和力、高特異性的納米抗體。

目前弓形蟲病的臨床診斷需要合并臨床癥狀與流行病史，同時(shí)符合病原學(xué)分離陽性、核酸陽性或循環(huán)抗原(CAg)陽性中的任一條。傳統(tǒng)的直接鏡檢、動物接種等病原學(xué)檢查方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢出率低，易漏檢，無法滿足早期診斷要求。分子生物學(xué)診斷如以弓形蟲基因組中SAG1、B1和529 bp重復(fù)序列等為靶基因建立的PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)等核酸快速檢測技術(shù)具有準(zhǔn)確率以及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)(Holec-Gasior, 2013)，但核酸檢測的方法并不適用于弓形蟲隱形感染、產(chǎn)前診斷以及免疫缺陷患者的診斷(Mengetal., 2012)，并且分子診斷技術(shù)容易形成氣溶膠污染，加之目前國內(nèi)大多是實(shí)驗(yàn)室不能做到嚴(yán)格分區(qū)，存在一定的假陽性。我國目前經(jīng)過國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的弓形蟲檢測試劑只包含IgG和IgM抗體的檢測，IgM抗體陽性具有弓形蟲感染早期診斷價(jià)值，不能作為急性感染的診斷依據(jù)(Abdizadehetal., 2015)；IgG陽性則可作為有感染發(fā)生的參考依據(jù)但不能確定感染時(shí)間，不能區(qū)分是過往感染還是現(xiàn)癥感染(Holec-Gasioretal., 2012)。免疫學(xué)診斷方法建立在抗原抗體之間的免疫學(xué)反應(yīng)，通過特異性結(jié)合的抗原或是抗體實(shí)現(xiàn)彼此檢測識別與檢測的目的。雖然免疫診斷法是弓形蟲病實(shí)驗(yàn)診斷的主要手段，但目前仍以弓形蟲抗體檢測為主，對弓形蟲抗原的檢測迄今未取得突破性進(jìn)展。本研究成功制備的弓形蟲納米抗體在免疫反應(yīng)中具有良好的敏感性，下一步我們將繼續(xù)對已經(jīng)構(gòu)建的弓形蟲納米抗體文庫進(jìn)行限制性條件篩選，同時(shí)也會對所獲得的弓形蟲納米抗體進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑?，以期?shí)現(xiàn)弓形蟲早期感染的體外快速診斷試劑的研制。