張楊明慧 張學(xué)星 趙 艷 魏海潮 胡鈺冰 龐 維 王慶輝 曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽 110122)

瘧疾的高發(fā)病率和致死率造成全世界嚴(yán)重的健康負(fù)擔(dān)，其中，間日瘧原蟲已成為全球分布最廣的瘧原蟲種類(Battleetal., 2019)。開發(fā)血液期疫苗是抗瘧最具實(shí)際效能的策略之一，由于裂殖子表面呈現(xiàn)高度多態(tài)性的抗原常介導(dǎo)瘧原蟲的免疫逃避(Patarroyoetal., 2020)，進(jìn)而針對(duì)多態(tài)性抗原的疫苗無法誘導(dǎo)廣泛的交叉保護(hù)作用，僅顯示出對(duì)同源蟲株的功效(Ouattaraetal., 2015)。因此，研究間日瘧原蟲候選抗原的遺傳多樣性對(duì)規(guī)避抗原變異及后續(xù)疫苗的設(shè)計(jì)與評(píng)估至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲的初始入侵由裂殖子表面蛋白與宿主細(xì)胞相應(yīng)配體的結(jié)合介導(dǎo)(Cowmanetal., 2017)。目前，僅報(bào)道了兩種與間日瘧原蟲裂殖子入侵網(wǎng)織紅細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵受體—配體相互作用，即間日瘧原蟲達(dá)菲結(jié)合蛋白1—達(dá)菲抗原趨化因子受體(PvDBP1-DARC)和間日瘧原蟲網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白2b—轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(PvRBP2b-CD71)(Patarroyoetal., 2020)。近年一項(xiàng)研究從柬埔寨間日瘧患者的基因組(C127)中鑒定出一種新型紅細(xì)胞結(jié)合蛋白(EBP)，屬紅細(xì)胞結(jié)合樣(EBL)蛋白超家族的成員，與間日瘧原蟲達(dá)菲結(jié)合蛋白(DBP)同源，預(yù)測(cè)其具有存在II區(qū)富含半胱氨酸保守的達(dá)菲結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域(DBL)和C端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(Hesteretal., 2013)。進(jìn)一步功能研究還表明，重組PvEBP不直接依賴DARC，優(yōu)先與未成熟并高表達(dá)CD71的網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合，并表現(xiàn)出與達(dá)菲陰性網(wǎng)織紅細(xì)胞的最小結(jié)合能力，由此推測(cè)PvEBP可能是驅(qū)動(dòng)間日瘧原蟲侵襲網(wǎng)織紅細(xì)胞的替代途徑，使得間日瘧原蟲非常規(guī)侵襲達(dá)菲陰性網(wǎng)織紅細(xì)胞(Ntumngiaetal., 2016; Golassaetal., 2020)。在瘧疾流行區(qū)，間日瘧患者體內(nèi)還可檢測(cè)到高分泌水平的PvEBP-RII抗體，該抗體對(duì)臨床間日瘧顯示出較強(qiáng)的獨(dú)立保護(hù)作用(Heetal., 2019)。此外，通過對(duì)馬達(dá)加斯加流行區(qū)間日瘧分離株分析證實(shí)PvEBP-RII蛋白在介導(dǎo)瘧原蟲侵襲紅細(xì)胞過程中的重要作用，并提出其可作為誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生獲得性免疫的重要靶標(biāo)(Roeschetal., 2018)。

本研究通過對(duì)PvEBP的遺傳多樣性、基因中性選擇和分化程度及其單倍型網(wǎng)絡(luò)圖聚類研究，揭示出PvEBP在中國中部地區(qū)及周邊國家邊境地區(qū)流行特點(diǎn)，為尋找有效的、特異性的疫苗靶向位點(diǎn)提供新的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

TIANamp Blood Spots DNA Kit(DP334-03)購于中國天根公司，10×KOD-Plus-Neo 緩沖液、dNTPs、MgSO4、DL2000 DNA Marker(3427 A)和10×Loading Buffer(KA1801 A)購于日本TaKaRa公司，KOD-Plus-Neo DNA聚合酶(KOD-401)購于日本TOYOBO公司。

1.2 間日瘧原蟲樣本采集

經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)和緬甸衛(wèi)生體育部醫(yī)學(xué)研究系倫理委員會(huì)審批，并獲得所有參與者及其監(jiān)護(hù)人的知情同意下，本研究共采集到53份間日瘧原蟲患者血液樣本(濾紙血及血涂片)，其中包括2009年中國(安徽，n=31)和2016年緬甸(Laiza，n=22)樣本。同時(shí)從GenBank中獲取越南間日瘧原蟲樣本序列24例(MN853276—MN853300)和緬甸間日瘧原蟲樣本序列10例(MN853178—MN853187)(Hanetal., 2020)，對(duì)所有樣本進(jìn)行基因多態(tài)性和種群遺傳學(xué)的分析。

1.3 PvEBP基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)TIANamp Blood Spots DNA Kit試劑盒說明書，從采集到的53份間日瘧原蟲感染患者的干濾紙血片中提取間日瘧原蟲基因組DNA。以提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增PvEBP基因(核苷酸位點(diǎn)：1～2 453 bp)，特異性引物F1: 5′-C T G T A C T T G T T T T G G T C A A T T T G T G T A GC-3′，R1: 5′-G T A T G A T C C A T G A T T C A T A G G C T G T G C A TG-3′，F(xiàn)2: 5′-T G G A C T T C T T A A C G A A A A T A G A T G C A A T A A CG-3′，R2: 5′-A C A T A T T T C C T G A C T T G T T T G C C G CC-3′。30 μL的PCR反應(yīng)體系包括：10×KOD-Plus-Neo buffer，2 mmol/L dNTPs，25 mmol/L MgSO4，0.6 U KOD-Plus-Neo DNA聚合酶，0.2 μL上下游引物及1 μL DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)條件均為：94℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 30 s，68℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；68℃ 7 min。取用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，送至北京諾賽基因公司測(cè)序，測(cè)序引物為：SGM-A3825: 5′-A C C T T A A C C T C G T C A G T G AA-3′，SGM-A3826: 5′-A T T G C G A T T C A G T G T T T A G TG-3′；SGM-I7182: 5′-T C G T C A G T C C C T T C T C A A A T C AA-3′，SGM-A3828: 5′-T G T C C T G G A A A A G T T A T GC-3′。

1.4 PvEBP基因序列比對(duì)與多態(tài)性分析

測(cè)序得到的序列及GenBank中下載的PvEBP基因序列通過MEGA7.0軟件進(jìn)行拼接，并以參考序列C127(GenBank: KC987954.1)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DNA序列比對(duì)。通過DnaSP 6.12.03軟件計(jì)算分離位點(diǎn)數(shù)目(number of segregating sites, S)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)、單倍體型數(shù)目(number of haplotypes, H)和單倍型多樣性(haplotype diversity, Hd)。

1.5 PvEBP基因的中性檢驗(yàn)及基因重組分析

為確定PvEBP基因是否偏離中性選擇及存在的自然選擇壓力，使用DnaSP 6.12.03軟件計(jì)算Tajima′s D，F(xiàn)u-Li′s F*&D*檢驗(yàn)值。根據(jù)MEGA7.0中改良的Nei-Gojobori方法，基于密碼子選擇的Z檢驗(yàn)計(jì)算非同義替換(dN)和同義替換(dS)的比率。使用DnaSP 6.12.03軟件評(píng)估基因的最小重組事件(Rm)。

1.6 PvEBP基因的群體分化(Fst)檢驗(yàn)

通過ARLEQUIN v3.5.2.2軟件中Wright固定指數(shù)(Fst)計(jì)算等位基因頻率的差異，衡量PvEBP基因在不同群體間的分化程度和遺傳結(jié)構(gòu)(Excoffieretal., 2010)。Fst的取值范圍為0-1，當(dāng)取值為0時(shí)，意味著不同地方群體遺傳結(jié)構(gòu)完全一致，群體間沒有分化；取值為0.15時(shí)，認(rèn)為群體間存在較大程度的遺傳分化；取值為1時(shí)，表明等位基因在各地方群體中固定，完全分化。

1.7 PvEBP基因系統(tǒng)發(fā)育及單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

采用MEGA 7.0中鄰接法對(duì)所有序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并通過1000次重復(fù)步長(zhǎng)檢驗(yàn)并得出節(jié)點(diǎn)可信值，從而推測(cè)對(duì)比PvEBP基因在不同地區(qū)之間的關(guān)聯(lián)程度及親緣關(guān)系。采用PopART 1.7中中位數(shù)連接法繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，以探討出PvEBP基因在種群間的譜系關(guān)系。

表1 流行區(qū)分離株P(guān)vEBP基因序列多樣性分析

圖1 PvEBP氨基酸多態(tài)位點(diǎn)頻率及分布

2 結(jié)果

2.1 PvEBP基因多樣性特征

對(duì)比3個(gè)地區(qū)間日瘧原蟲分離株P(guān)vEBP基因(1-2 325 bp)的多態(tài)性，中國安徽PvEBP基因核苷酸多樣性(π=0.00051)和單倍型多樣性(Hd=0.634)較低，緬甸PvEBP基因核苷酸多樣性(π=0.00149)和越南PvEBP基因單倍型多樣性(Hd=0.790)較高(表1)。從氨基酸位點(diǎn)上共得到20處非同義突變和3處同義突變，且主要發(fā)生在PvEBP-RII中(圖1-A)。3個(gè)地區(qū)分離株中均存在N233K，D311N和E322K位點(diǎn)突變，其中后者E322K在中國安徽的突變率較高(87.1%)(圖1-B)。

2.2 PvEBP-RII基因自然選擇和重組分析

緬甸分離株P(guān)vEBP-RII的Tajima′s D>0，F(xiàn)u-Li′s F*&D*>0，中國安徽和越南分離株P(guān)vEBP-RII的中性檢驗(yàn)值均為負(fù)值，所有研究地區(qū)分離株P(guān)vEBP-RII均有dN/dS>1。僅在緬甸的分離株中PvEBP-RII存在最小基因重組事件(Rm=1)(表2)。

2.3 PvEBP基因在不同群體間的分化

種群分化結(jié)果顯示PvEBP基因在兩兩地區(qū)間均存在較高的遺傳分化，且遺傳差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中中國安徽與緬甸及越南間的遺傳分化程度較大(Fst>0.15)(表3)。

2.4 不同群體間PvEBP基因進(jìn)化關(guān)系

依據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示出不同地區(qū)PvEBP基因存在較為明顯的地理聚類，各地區(qū)間序列相似性較小(圖2-A)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示地理隔離導(dǎo)致的單倍型分布具有地區(qū)差異性，其中Hap_4是頻率最高且所有群體共享的單倍型，除緬甸特有的單倍型Hap_7和Hap_11外，大部分單倍型之間僅有一步或兩步突變。中國安徽僅有3個(gè)特有的單倍型(Hap_1，Hap_3，Hap_5)，緬甸的單一單倍型數(shù)最多(圖2-B)。

表2 分離株P(guān)vEBP-RII基因自然選擇和基因重組分析

表3 各流行區(qū)間PvEBP基因的遺傳分化程度

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，裂殖子入侵網(wǎng)織紅細(xì)胞是所有瘧原蟲血液階段發(fā)育的關(guān)鍵，入侵配體家族一直是疫苗設(shè)計(jì)的靶標(biāo)(Thametal., 2017)。基因多態(tài)性介導(dǎo)的瘧原蟲免疫逃逸是制約疫苗有效性的關(guān)鍵因素(Garzón-Ospinaetal., 2018)。盡管已有研究表明PvEBP可充當(dāng)間日瘧原蟲入侵網(wǎng)織紅細(xì)胞的替代配體，但遺傳多樣性和種群進(jìn)化特征分析是評(píng)估PvEBP作為候選疫苗抗原的前提。本研究通過對(duì)我國中部安徽及周邊國家緬甸和越南邊境地區(qū)的PvEBP基因特征分析發(fā)現(xiàn)，各流行區(qū)PvEBP基因存在遺傳差異，氨基酸突變位點(diǎn)主要集中在PvEBP-RII，提示此功能區(qū)為間日瘧血液階段疫苗研制的靶點(diǎn)。PvEBP基因在不同群體中呈現(xiàn)較大的遺傳分化。同時(shí)出現(xiàn)在3個(gè)地區(qū)中的頻率最高的單倍型(Hap_4)可能成為研制PvEBP疫苗的基礎(chǔ)。

遺傳多樣性分析顯示，與周邊國家相比，我國安徽分離株P(guān)vEBP基因核苷酸多樣性和單倍體數(shù)目(π=0.00051，Hd=0.634)相對(duì)較低。這可能是由于間日瘧輸入病例的阻斷，使得我國中部省份間的基因流動(dòng)受限造成的(Liuetal., 2014)。此外，也可能由于溫帶地區(qū)間日瘧原蟲休眠期較長(zhǎng)，多克隆感染的發(fā)生率普遍較低，從而減少了基因重組的概率，降低了PvEBP基因多樣性(Petersenetal., 2013)。緬甸和越南間日瘧流行水平較高，且流動(dòng)性較大(Brashearetal., 2020)，使得它們的PvEBP基因多態(tài)性較高。

以往研究發(fā)現(xiàn)，PvDBP-RII區(qū)中的DBL結(jié)構(gòu)域具有可介導(dǎo)交叉反應(yīng)的表位，介導(dǎo)寄生蟲粘附(Mitranetal., 2019)，提示DBL結(jié)構(gòu)域作為開發(fā)間日瘧原蟲入侵紅細(xì)胞疫苗靶點(diǎn)的潛能(Singhetal., 2006)。本研究結(jié)果也顯示，PvEBP-RII遺傳多樣性相對(duì)較高，氨基酸突變主要集中于PvEBP-RII，結(jié)合各流行區(qū)PvEBP-RII的選擇壓力分析結(jié)果(dN/dS>1)，提示PvEBP-RII基因可能受到正向選擇壓力的影響。已有報(bào)道顯示抗PvEBP-RII的抗體在間日瘧感染患者中顯著升高(Hanetal., 2020)，進(jìn)一步證實(shí)PvEBP-RII是免疫系統(tǒng)識(shí)別的部位，可成為間日瘧血液階段疫苗研制的合適靶標(biāo)。

圖2 群體間PvEBP基因的進(jìn)化關(guān)系

系統(tǒng)發(fā)育樹分析種群分化結(jié)果顯示(圖2-A)，短時(shí)期內(nèi)群體間的PvEBP基因交流不頻繁，同一群體的分離株聚集明顯且群體間序列相似性不高。同樣，與PvEBP同源的諾氏瘧原蟲紅細(xì)胞結(jié)合蛋白(PkEBP)在馬來西亞兩地區(qū)也表現(xiàn)出中等程度的遺傳分化，提示地理隔離導(dǎo)致寄生蟲不同的進(jìn)化方向(Wangetal., 2019)。由于地理局限性導(dǎo)致極少的基因遷移和遺傳漂變，PvEBP基因在不同群體中呈現(xiàn)較大的遺傳分化(表3)，應(yīng)根據(jù)地區(qū)遺傳特點(diǎn)開發(fā)更加有效的瘧疾疫苗。本研究中，頻率最高的單倍型(Hap_4)同時(shí)出現(xiàn)在3個(gè)不同流行區(qū)，提示該單倍體型具有地區(qū)適應(yīng)性，以此為基礎(chǔ)的疫苗在這3個(gè)流行區(qū)可能有效，然而，此單倍型的抗原性尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。