李超杰 姜玉庭 張強輝 高 劍 劉 源 邢 丹 李春曉 張恒端 郭曉霞** 趙彤言**

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點實驗室，北京 100071)

登革病毒(Dengue fever virus，DENV)屬于黃病毒科、黃病毒屬，是有囊膜包被的單股正鏈RNA病毒(Thanachartwetetal., 2015)。病毒基因組全長約 11 kb，有1個開放閱讀框(Open reading frame, ORF)，共編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(Unoetal., 2018)。根據(jù)病毒表面抗原的不同，可以分為4種不同的血清型(DENV-1～DENV-4)。埃及伊蚊Aedesaegypti和白紋伊蚊Aealbopictus是登革熱的主要傳播媒介，其中白紋伊蚊在中國的分布極其廣泛，自遼寧省往南的各個省份均有分布。

目前定量檢測登革病毒的方法主要是通過實時熒光定量檢測登革病毒的含量(Gongetal., 2020)。Alto等(2008)用DENV-2感染伊蚊，發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊身體中病毒滴度與蚊蟲個體大小成正相關(guān)，這可能是由于大個體蚊蟲攝入了更多的病毒，但是傳統(tǒng)的定量檢測方法的結(jié)果因樣本個體差異存在誤差。建立白紋伊蚊中登革病毒含量的精確檢測方法，對于白紋伊蚊感染登革病毒的研究以及登革熱的防控有重要意義。肌動蛋白(Actin) 是一類形成微絲的球狀多功能蛋白質(zhì)，普遍存在于所有的真核細胞中, 是高度保守的蛋白質(zhì)家族，其在進化的過程中幾乎沒有變化。肌動蛋白幾乎參與了真核細胞的所有生理過程, 如胞質(zhì)流動、細胞器運動、細胞分裂、染色體運動、細胞激化等(Pollardetal., 1986；Kabschetal., 1992；Chadwicketal., 1999)。由于肌動蛋白的mRNA的表達數(shù)量高并且表達穩(wěn)定，在生物體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達, 所以在很多研究中被當(dāng)作內(nèi)參基因(Vascottoetal., 2004)。

本研究采用白紋伊蚊Actin基因表達含量做參照，設(shè)計DENV-2和Actin特異性引物和探針進行一步法熒光定量雙重PCR檢測，使登革Ⅱ型病毒感染白紋伊蚊的實時熒光定量結(jié)果更為準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 白紋伊蚊

研究對象為廣州株白紋伊蚊，2019年7月采自廣東省廣州市，于養(yǎng)蟲室連續(xù)常規(guī)養(yǎng)殖至第4代(F4)。飼養(yǎng)條件：溫度28±1℃，相對濕度70%±5%，光照∶黑暗=14 h∶10 h。

1.2 登革Ⅱ型病毒

登革Ⅱ型病毒由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，在本實驗室經(jīng)乳鼠腦傳代，保存于-80℃冰箱。

1.3 主要儀器和試劑

Analytikjena PCR儀(Biometra Tadvanced)、QuantStudio 7 Flex實時熒光定量 PCR儀(appliedbiosystems)、醫(yī)學(xué)昆蟲供血器(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗儀器廠)、RNAiso Plus(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，貨號：RR047 A)、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，貨號：RR010 A)、低熔點瓊脂(SIGMA公司：SLBJ0416 V)、 EasyPure? Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號：EG101-01)、pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號：CB501)、EasyPure?HiPure Plasmid MiniPrep Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號：EM111-01)、GoTaq?Probe 1-Step RT-qPCR System試劑盒(Promega公司，貨號：A6120)。

1.4 引物和探針合成

針對登革Ⅱ型病毒3′UTR區(qū)域和白紋伊蚊Actin基因保守區(qū)設(shè)計引物，登革Ⅱ型病毒基因和白紋伊蚊Actin基因的探針5'端標(biāo)記的熒光基團分別為FAM和HEX。引物序列在華大基因合成。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別提取白紋伊蚊和DENV-2的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，PCR擴增分別獲得白紋伊蚊Actin和DENV-2目的片段(反應(yīng)條件：95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35 cycles; 72℃ 5 min)。將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用凝膠回收試劑盒純化目的片段。將純化后的目的片段與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，復(fù)蘇培養(yǎng)1 h，涂在準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑選白色菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，測序。將含目的基因的菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測得質(zhì)粒濃度，計算出目的基因相對應(yīng)的拷貝數(shù)。把已知濃度的質(zhì)粒稀釋至108～101copies/μL，作為后續(xù)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 一步法實時熒光定量 PCR方法的靈敏度和重復(fù)性

將構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋為1×108～1×101copies /μL系列梯度濃度，確定所建立方法的最低檢測拷貝數(shù)；實驗重復(fù)3次，計算3次之間的平均Ct值及各梯度濃度的變異系數(shù)，檢驗穩(wěn)定性。

1.7 白紋伊蚊經(jīng)口感染DENV-2

白紋伊蚊羽化5～7 d后斷糖水16～18 h，使用醫(yī)學(xué)昆蟲供血器喂食病毒血餐。血餐用登革Ⅱ型病毒懸液和昆明小鼠血按1∶1的比例混合而成，DENV-2的滴度為6.9×107PFU/mL。喂食白紋伊蚊1 h后，使用CO2麻醉，挑取飽血的雌蚊100只，感染后蚊蟲置于溫度28±1℃，相對濕度70%±5%，光照：黑暗=14 h:10 h的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.8 白紋伊蚊總RNA提取和檢測

分別于染毒后第4、7、10 d取30只白紋伊蚊，處死后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL RNAiso Plus提取蚊蟲總RNA。使用Promega一步法實時熒光定量試劑盒檢測白紋伊蚊體內(nèi)DENV-2的含量和Actin基因的表達量(反應(yīng)條件：45℃ 15 min; 95℃ 10 min, 95℃ 15 s, 60℃ 60 s, 40 cycles)。

2 結(jié)果

2.1 一步法實時熒光定量 PCR 方法的靈敏度和重復(fù)性

用上述條件建立一步法實時熒光定量 PCR 檢測拷貝數(shù)分別為1×108～1×101copies /μL的DENV-2和白紋伊蚊Actin基因重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示DENV-2的最低檢測濃度為1×102copies /μL，而白紋伊蚊Actin基因的最低檢測濃度為1×101copies /μL。DENV-2標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖1)的線性回歸方程為y=-3.8894x+ 42.552，相關(guān)系數(shù)0.999，白紋伊蚊Actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖2) 的線性回歸方程為y=-3.8814x+ 42.768，相關(guān)系數(shù)0.999，兩者標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的相關(guān)關(guān)系。上述實驗重復(fù)檢測3次后，DENV-2重組質(zhì)粒的變異系數(shù)在0.79%～2.66%之間(表2)，白紋伊蚊Actin基因重組質(zhì)粒的變異系數(shù)在0.38%～4.33%之間 (表3)，變異系數(shù)較大的樣本濃度主要是1×101copies /μL，證明該檢測方法在1×102～1×108copies /μL之間重復(fù)性最好。

圖1 梯度稀釋登革Ⅱ型病毒陽性模板核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 梯度稀釋白紋伊蚊Actin基因陽性模板核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 不同天數(shù)白紋伊蚊登革Ⅱ型病毒與Actin基因表達量的比值

2.2 登革Ⅱ型病毒復(fù)制動態(tài)檢測

根據(jù)上述方法，檢測白紋伊蚊吸食DENV-2型病毒血餐后，登革Ⅱ型病毒和白紋伊蚊Actin基因的表達量在第4、7和10 d的變化情況 (圖3)。在第4 d DENV-2的感染率為0%，第7 d的感染率為37%，第10 d的感染率為30%。第7 d DENV-2與Actin基因的比值在0.51～0.93之間，第10 d DENV-2與Actin基因的比值在0.63～0.94之間(表4)。第7 d陽性蚊蟲比值的平均值為0.72，標(biāo)準(zhǔn)差為0.17；第10 d陽性蚊蟲比值的平均值為0.80，標(biāo)準(zhǔn)差為0.09，應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計軟件，第10 d的比值平均值高于第7 d的比值平均值，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，即第10 d的病毒含量高于第7 d的病毒含量(表5)。

表1 登革Ⅱ型病毒和Actin的引物及探針序列

表2 登革Ⅱ型病毒檢測時各梯度濃度的Ct值及變異系數(shù)

表3 白紋伊蚊Actin基因檢測時各梯度濃度的Ct值及變異系數(shù)

表4 陽性蚊蟲DENV-2與Actin基因表達量的比值

表5 陽性蚊蟲DENV-2與Actin基因表達量比值的比較

3 討論

目前常用的登革病毒檢測方法為僅使用病毒特異性引物和探針對病毒進行絕對定量分析(Houetal., 2013)，但是即使是同時孵化的一籠蚊蟲，其個體大小也存在較大的差異。Fish(1985)調(diào)查了美國東北地區(qū)10種雌性成蚊的個體大小，其變異系數(shù)(CV)為10.51%～38.13%。在野生環(huán)境中，個體大的蚊蟲擁有更長的生命，更強的飛行能力和遷徙能力，因此能有更多的機會吸食宿主的血液，擁有更強的競爭優(yōu)勢與疾病傳播能力(Haramis, 1985; Nasci, 1986)。Alto等(2008)的研究表明在實驗室條件下，小個體白紋伊蚊和埃及伊蚊比大個體蚊蟲更容易感染和播散DENV-2。但是在感染了病毒的埃及伊蚊中，身體中病毒滴度與個體大小成正相關(guān)，作者給出的解釋是大個體蚊蟲擁有更多供病毒復(fù)制的組織。但我們認為大個體蚊蟲可以一次攝入更多的病毒血餐，這可能在對比不同處理條件下病毒載量的實驗中帶來影響，而用病毒核酸與內(nèi)參表達量的比值來反映每個蚊蟲個體中病毒的量則能消除個體大小帶來的差異，結(jié)果更加具有說服力。

在本研究中，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999，擬合效果較好。每個標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本3次重復(fù)的變異系數(shù)均不超過5%，重復(fù)性較好。DENV-2和Actin的最低檢測濃度分別為102和101copies/μL，靈敏度較高。另外本研究中的白紋伊蚊Actin引物同樣可用于C6/36細胞的檢測(數(shù)據(jù)未展示)。