羅孝美，韓笑，彭昌，鄧玲，黃麗欣

孕期飲酒可致胎兒酒精綜合征，心臟發(fā)育畸形便是該綜合征較為嚴(yán)重的畸形之一[1-2]。但遺憾的是，酒精暴露致心臟發(fā)育異常的機(jī)制仍不清楚。本課題組前期研究證實(shí)[3-4]，組蛋白乙酰化修飾失衡參與介導(dǎo)了孕期酒精暴露致胎鼠心臟發(fā)育異常；但組蛋白乙酰化修飾失衡并不能完全解釋酒精暴露致心臟發(fā)育畸形。近年研究證實(shí)[5-6]，DNA 甲基化是表觀遺傳中的另一種重要修飾方式直接參與了心臟發(fā)育的調(diào)控。之前本課題組另一項(xiàng)研究也證實(shí)組蛋白甲基化和乙?；换フ{(diào)控在心臟發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[7]。因此，推測(cè)在酒精暴露致心臟發(fā)育異常的過(guò)程中甲基化修飾失衡可能也發(fā)揮了重要調(diào)控作用。故本研究以DNA 甲基化修飾為切入點(diǎn)探討孕期酒精暴露對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，希望對(duì)孕期飲酒致子代心臟發(fā)育異常的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康性成熟SPF 級(jí)昆明小鼠作為研究對(duì)象，昆明小鼠購(gòu)置于重慶醫(yī)科大學(xué)，按雌 :雄=2 :1合籠，次晨發(fā)現(xiàn)陰栓雌鼠胎齡記為0.5 d。將孕鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4 組：正常組、對(duì)照組、酒精組、干預(yù)組，每組6 只。在胎齡 0.5 d～16.5 d期間，酒精組每日給予56%酒精5 ml/kg 灌胃1 次，干預(yù)組在給予56%酒精的基礎(chǔ)上每日腹腔注射1次DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）特異性抑制劑5-氮雜胞苷（2.5 mg/kg），對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃及等量二甲基亞砜（DMSO）腹腔注射，正常組未給予任何處理。

1.2 小鼠心臟標(biāo)本制備

至孕期16.5 d，二氧化碳麻醉處死孕鼠，剖開(kāi)腹腔找到串珠樣子宮取出胚胎并收集胎齡16.5 d 胎鼠心臟放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器及試劑

熒光定量PCR儀（Bio-Rad，CFX96，美國(guó)），Agena MassArray DNA 質(zhì)譜分析系統(tǒng)（Agena Bioscience，美國(guó)），抗心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）單克隆抗體（Abcam，英國(guó)），抗心房利鈉肽（ANP）抗體（Santa Cruz，美國(guó)），β-actin 兔來(lái)源多克隆抗體（中杉金橋，北京），辣根過(guò)氧化物酶（hHRP）標(biāo)記山羊抗兔的二抗（中杉金橋，北京），DNA 提取試劑盒（BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司），熒光定量PCR 試劑盒（Takara，大連寶生物工程有限公司），DNA 提取及純化試劑盒（Solarbio，北京索萊寶科技有限公司），DNMT 測(cè)定試劑盒（GENMED，美國(guó)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 心肌組織DNA 提取及純化

胎鼠心肌組織使用液氮研磨成粉末狀，再用酚抽提法即可得到基因組DNA。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4.2 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)報(bào)道[8]運(yùn)用DNMT 測(cè)定試劑盒檢測(cè)胎鼠心肌組織中DNMT 活性，運(yùn)用OD=450 nm 波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。DNMT 活性[OD/（h·mg）]=（樣品OD-空白OD）×1 000/[樣品蛋白量（μg）×孵育時(shí)間（h）]。

1.4.3 心臟核心轉(zhuǎn)錄因子心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A 啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化測(cè)序

參照文獻(xiàn)報(bào)道甲基化測(cè)序方法[9]，整理待檢測(cè)CpGs 序列信息成標(biāo)準(zhǔn)格式，將目的序列輸入到EpiDesigner 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，合成引物。通過(guò)酶標(biāo)儀及凝膠電泳檢測(cè)DNA 濃度及純度。NaHSO3處理待測(cè)DNA 樣本。對(duì)DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)、蝦堿酶（SAP）消化反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄和酶切反應(yīng)。樹(shù)脂純化后通過(guò)Agena MassArray 系統(tǒng)（Agena Bioscience，美國(guó)）檢測(cè)DNA 甲基化。根據(jù)含G 峰和含A 峰的面積比較，計(jì)算出待檢樣品甲基化及非甲基化程度，屬于兩者相對(duì)定量比值，檢測(cè)所得的原始數(shù)據(jù)，即代表該樣品中對(duì)應(yīng)甲基化位點(diǎn)的甲基化程度。

1.4.4 染色質(zhì)免疫共沉淀

取胎鼠心臟組織30 mg，預(yù)冷磷酸緩沖液清洗后加入終濃度為1 %的甲醛交聯(lián)。超聲切割DNA至200 bp～1 000 bp 之間。加入染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）級(jí)抗心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子（MEF2A）抗體4 ℃搖床過(guò)夜沉淀DNA 片段和蛋白質(zhì)復(fù)合物，65 ℃水浴逆轉(zhuǎn)交聯(lián)6 h～ 8 h，純化和回收DNA 片段。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定A260 nm/A280 nm 比值，以確定ChIP 后DNA 的濃度及純度，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.4.5 蛋白免疫印跡法

提取胎鼠心肌組織核蛋白，8 % SDS-PAGE 凝膠分離核蛋白，PVDF 膜半干轉(zhuǎn)膜后，5 %脫脂牛奶封閉2 h 后分別加入兔來(lái)源抗ANP、cTnT、β-MHC單克隆抗體（1：1 000）及β-actin 兔來(lái)源多克隆抗體（1：1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST（100 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，20% Tween 20，pH7.4）洗滌3 次，每次15 min，然后加入h HRP 標(biāo)記山羊抗兔的二抗（1：5 000）脫色搖床上孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次15 min，運(yùn)用Bio-Rad 圖像分析儀進(jìn)行圖像掃描；采用Quantity One 4.4 軟件進(jìn)行分析。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列和退火溫度

針對(duì)MEF2A 基因CDS 核心編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，引物用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，由大連寶生物公司合成。將MEF2A 基因產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)\(yùn)用Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀擴(kuò)增，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到R2值和擴(kuò)增效率。引物序 列：MEF2A(F)5'-CAGGTGGTGGCAGTCTTGGA-3'，MEF2A(R) 5'-TGCTTATCCTTTGGGCATTCA-3'，產(chǎn)物大?。?60 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃ 30 s，變性：95 ℃ 5 s，退火延伸：58 ℃ 30 s，39 個(gè)循環(huán)。選取β-actin 作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)用Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀自帶基于pfaffl 原理的相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)性變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

胎鼠心肌組織中DNMT 活性（表1）：比色法結(jié)果顯示，胎鼠心肌組織中DNMT 活性在酒精組和DNMT 抑制劑5-氮雜胞苷干預(yù)組較對(duì)照組和正常組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而對(duì)照組較正常組DNMT 活性未見(jiàn)明顯變化，兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 孕期酒精暴露對(duì)胎鼠心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平及DNMT 活性的影響a（）

表1 孕期酒精暴露對(duì)胎鼠心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平及DNMT 活性的影響a（）

注：a：除比較胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平為各組3 只胎鼠外，余者均為6 只。DNMT：DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；MEF2A：心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A；mRNA：信使RNA；ANP：心房利鈉肽；cTnT：心肌肌鈣蛋白；β-MHC：β-肌球蛋白重鏈。與對(duì)照組和正常組相比*P＜0.05

心臟發(fā)育核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子CpG 島DNA 甲基化水平（表1、圖1）：心臟發(fā)育核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子區(qū)CpG 島測(cè)序結(jié)果表明，酒精組和干預(yù)組小鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子+75 bp 和+325 bp DNA 甲基化水平較對(duì)照組和正常組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。

圖1 胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化檢測(cè)凝膠圖和圓點(diǎn)圖（n=3）

心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A mRNA 水平（表1）：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示：酒精組和干預(yù)組小鼠心肌組織中心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A mRNA 水平較對(duì)照組和正常組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。

心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 對(duì)心臟發(fā)育結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控作用（圖2）：ChIP 結(jié)果表明，小鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 能夠結(jié)合到心臟發(fā)育相關(guān)結(jié)構(gòu)基因ANP、cTnT 及β-MHC 啟動(dòng)子區(qū)域，因而可能直接參與上述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

心臟結(jié)構(gòu)基因ANP、cTnT 和β-MHC 的表達(dá)水平（表1、圖3）：蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與對(duì)照組和正常組相比，酒精組和干預(yù)組的心臟結(jié)構(gòu)基因ANP、cTnT 及β-MHC 的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。

圖2 染色質(zhì)免疫共沉淀分析胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A對(duì)心臟結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的結(jié)合作用（n=3）

圖3 Western blot 分析各組胎鼠心臟發(fā)育結(jié)構(gòu)基因ANP、cTnT 和β-MHC 的蛋白水平（n=6）

3 討論

孕期飲酒可以導(dǎo)致胎兒心臟發(fā)育畸形，但具體機(jī)制不清楚。小鼠心臟發(fā)育過(guò)程與人類(lèi)非常相似，故本研究通過(guò)酒精暴露孕期小鼠來(lái)探討酒精對(duì)小鼠心臟發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒精暴露的子代小鼠心臟組織中DNMT 活性較對(duì)照組顯著減低，DNA 甲基化測(cè)序結(jié)果也發(fā)現(xiàn)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在酒精組和干預(yù)組均顯著降低，為了進(jìn)一步證實(shí)甲基化變化在酒精暴露小鼠心臟中的作用，給予DNMT 抑制劑5-氮雜胞苷干預(yù)，結(jié)果也證實(shí)在子代小鼠心肌組織中DNMT活性和心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在干預(yù)組顯著降低，其變化趨勢(shì)與酒精暴露組的變化趨勢(shì)相一致。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 的轉(zhuǎn)錄水平在酒精暴露組及干預(yù)組顯著升高。這些結(jié)果均提示酒精介導(dǎo)的DNA 低甲基化可能參與了心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。心臟發(fā)育結(jié)構(gòu)基因的正確表達(dá)是構(gòu)建完美心臟的基礎(chǔ)，心臟發(fā)育結(jié)構(gòu)基因包含較多，如ANP、β-MHC、cTnT、cTnI、α-MHC、Cx43 等。本課題組前期研究[3-4,10]發(fā)現(xiàn)，ANP、β-MHC、cTnT 這幾個(gè)基因在酒精暴露及心肌肥厚的小鼠心肌組織中其表達(dá)水平出現(xiàn)明顯異常，提示這些基因與病理性心臟疾病中可能發(fā)揮重要作用。在本研究中檢測(cè)的ANP、β-MHC、cTnT的表達(dá)水平在酒精組和干預(yù)組均顯著升高，其變化趨勢(shì)與心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動(dòng)子DNA 甲基化水平相對(duì)應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，參與眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。ChIP 結(jié)果證實(shí)，心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 能夠結(jié)合到心臟結(jié)構(gòu)基因ANP、β-MHC、cTnT 啟動(dòng)子區(qū)參與這些基因的調(diào)控。因此，上述結(jié)果表明DNMT 介導(dǎo)的DNA 甲基化修飾失衡可能是孕期酒精暴露致子代小鼠心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常的重要調(diào)控因素。心臟發(fā)育是十分復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，任何微小的變化均會(huì)導(dǎo)致心臟發(fā)育異常[11-14]。國(guó)外研究證實(shí)[6,15-16]，甲基化修飾參與了哺乳動(dòng)物的心臟發(fā)育過(guò)程，且經(jīng)酒精干預(yù)的小鼠心臟組織中發(fā)現(xiàn)甲基化修飾異常。因此，本研究結(jié)果與國(guó)外研究相一致。但本研究?jī)H檢測(cè)了一部分心臟發(fā)育相關(guān)基因，其他心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況如何以及是哪些DNMT 亞型在其中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。