孫晨敏，邵繼海，匡曉琳

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128）

畜禽養(yǎng)殖的飼料中普遍含有重金屬添加劑，其中Cu是最主要的重金屬添加劑之一[1]。而畜禽飼料中Cu的利用率較低，絕大部分會隨畜禽糞便外排，有文獻(xiàn)表明養(yǎng)殖廢水中Cu（Ⅱ）含量可以達(dá)到9.81 mg·L-1，遠(yuǎn)超過《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 8978—1996）中重金屬Cu（Ⅱ）的最高允許排放濃度（＜2.0 mg·L-1）[2-3]。為了解決這一問題，研究人員已經(jīng)開發(fā)了許多處理技術(shù)，例如吸附、化學(xué)氧化、離子交換、沉淀和膜分離[4-5]，其中吸附法（物理吸附、化學(xué)吸附和生物吸附）具有高效[6]、可循環(huán)利用[7]、環(huán)保等特點(diǎn)，由于大多數(shù)吸附劑的制備較為昂貴，只能在規(guī)?；鬯幚砩下砸姵尚?。而生物吸附法因具有吸附劑來源廣泛、成本低廉、吸附范圍廣等優(yōu)勢而在重金屬類污水處理中廣泛使用[8-9]。

周叢生物是淹沒于水體固體基質(zhì)表面的各種微生物及其與周邊的非生物物質(zhì)交織在一起的集合體[10-11]，周叢生物的多物種群落特征使其對重金屬的耐受性高于單一物種，如藻類[12-13]或細(xì)菌[14]。據(jù)Bradac等[15]和Yang等[16]的研究結(jié)果顯示，周叢生物能有效吸附去除多種重金屬離子，如Cu、Cd、Pb、Mn等。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)周叢生物對農(nóng)業(yè)固廢滲濾液中Cu（Ⅱ）的去除具有高效性和可持續(xù)性。周叢生物吸附重金屬通常會受pH、胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）中活性基團(tuán)等的影響[18]。周叢生物產(chǎn)生的胞外聚合物富集羥基、羧基、酰胺基等，還含有一些非碳水化合物成分，如磷酸鹽和硫酸鹽，這些化學(xué)基團(tuán)可以通過離子交換或絡(luò)合的方式與重金屬離子結(jié)合，從而將液體介質(zhì)中的重金屬離子去除[19-21]。

養(yǎng)殖廢水中含有的大量溶解性有機(jī)質(zhì)（Dissolved organic matter，DOM）[22]，主 要 來源于 畜禽糞 便[23]。DOM主要成分包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類、酚類、醇類、有機(jī)酸和固醇類，其中含有大量的氨基、羰基、羥基等基團(tuán)[24]，這些基團(tuán)同樣具有與水體重金屬離子結(jié)合的特性[25]。據(jù)此可以推測用周叢生物吸附法去除畜禽養(yǎng)殖廢水中重金屬離子時(shí)，其去除效率必然會受到畜禽養(yǎng)殖廢水中DOM的影響。然而到目前為止，這一科學(xué)問題卻尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為了闡明牛糞中DOM對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的特性的影響，本文對此進(jìn)行了研究，并結(jié)合解吸特性和紅外基團(tuán)分析結(jié)果，分析了DOM影響周叢生物吸附Cu（Ⅱ）特性的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 周叢生物的采集與處理

吸附試驗(yàn)所用周叢生物采集于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)第八教學(xué)樓的人工池塘底部鵝卵石表面。每次所用周叢生物均經(jīng)過抽濾以去除表面水分，再進(jìn)行稱量計(jì)算。

1.2 DOM的制備

牛糞來自湖南省畜牧獸醫(yī)研究所內(nèi)奶牛養(yǎng)殖中心。將牛糞風(fēng)干后過2 mm的尼龍篩，按照干物質(zhì)和超純水1∶20（W/V）的比例在25 ℃條件下，200 r·min-1振蕩24 h。12 000×g離心20 min，取上清液用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過濾，黑暗4℃保存。因牛糞來源DOM成分較復(fù)雜，故以總有機(jī)碳（Total organic carbon，TOC）濃度作為DOM的定量指標(biāo)，測得牛糞來源DOM母液的TOC濃度為2 372.25 mg·L-1。

1.3 吸附試驗(yàn)

1.3.1 不同DOM添加量對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的影響

本研究所有試驗(yàn)的Cu（Ⅱ）溶液均使用Cu（NO3）2·3H2O配制。取適量的周叢生物進(jìn)行抽濾，抽濾至不再滴水，用電子天平稱取0.3 g周叢生物分裝至塑料小瓶中，吸附體系的體積為30 mL，Cu（Ⅱ）初始濃度為5 mg·L-1，牛糞DOM的添加量分別為：0%、5%、10%、20%、30%（V/V）。吸附體系每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣。將塑料小瓶放入搖床振蕩吸附，溫度設(shè)置25℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1。待吸附達(dá)到平衡后，取8 mL溶液至離心管，于 10 000 r·min-1，離心 10 min。離心后取上清液1 mL至另一離心管并定容至5 mL，搖勻后用原子吸收分光光度儀測定其中Cu（Ⅱ）濃度，根據(jù)上清液中殘留的Cu（Ⅱ）量計(jì)算周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的量。

1.3.2 吸附動力學(xué)試驗(yàn)

設(shè)置兩組吸附試驗(yàn)，其中一組為添加牛糞DOM的試驗(yàn)組，另一組為不添加DOM的對照組。根據(jù)對養(yǎng)殖廢水TOC的測定結(jié)果，牛糞DOM的添加量設(shè)置為5%（相當(dāng)于TOC終濃度118 mg·L-1），該濃度接近奶牛養(yǎng)殖廢水中TOC含量。吸附條件與1.3.1相同。整個(gè)吸附體系采樣時(shí)間為第 5、10、20、30、60、120、180、240、300、360 min。取樣后，樣品的離心、Cu（Ⅱ）測定和吸附量的計(jì)算均與1.3.1相同。

為了探究吸附動力學(xué)，用準(zhǔn)一級動力學(xué)和準(zhǔn)二級動力學(xué)（公式1、公式2）對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

1.3.3 等溫吸附試驗(yàn)

在DOM添加量為5%，保持周叢生物量、溫度、振蕩頻率和時(shí)間等不變的條件下，研究不同Cu（Ⅱ）起始濃度對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的吸附容量的影響。Cu（Ⅱ）的初始濃度為5、10、20、40、80、160、200 mg·L-1。吸附條件、取樣后樣品的處理、上清液中Cu（Ⅱ）含量測定和吸附容量的計(jì)算均與1.3.1相同。

為了研究周叢生物以及周叢生物+DOM對Cu（Ⅱ）的等溫吸附特性，使用Langmuir和Freundlich模型（公式3、公式4）對其進(jìn)行擬合分析。

式中：qe為到達(dá)平衡時(shí)重金屬的吸附容量，ce為重金屬的平衡濃度，qm為最大吸附容量，b為吸附平衡常數(shù)；KF為吸附參數(shù)，n為吸附強(qiáng)度。

1.3.4 不同pH下DOM對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的影響

吸附體系中Cu（Ⅱ）濃度為5 mg·L-1，DOM添加量為 5%。使用 0.01 mol·L-1HNO3和 0.01 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)試驗(yàn)組和對照組的pH至4、5、6、7、8。吸附溫度、振蕩頻率和吸附時(shí)間及取樣后樣品的處理與上述1.3.1相同，計(jì)算不同pH條件下周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附量。

1.4 解吸附試驗(yàn)

試驗(yàn)組和對照組均在Cu（Ⅱ）濃度為5 mg·L-1、DOM添加量為5%的條件下進(jìn)行吸附試驗(yàn)，達(dá)到吸附平衡后按上述方法取樣和離心，取一部分上清液進(jìn)行濃度測定，剩余部分離心后去掉上清液，保留底物用超純水沖洗掉殘留液體，分別加入超純水、2 mol·L-1NH4NO3、0.1 mol·L-1EDTA-2Na作解吸試劑，解吸兩次后，用原子吸收光度計(jì)測定解吸液中Cu（Ⅱ）濃度。

1.5 樣品消解

將1.3.1和1.4試驗(yàn)后的周叢生物從體系中取出，放入50 mL消解管中，加入10 mL HNO3，蓋上漏斗靜置過夜，未做吸附試驗(yàn)的周叢生物也同時(shí)進(jìn)行消解。周叢生物中總Cu（Ⅱ）采用天津萊玻特瑞公司XJS36-42W型管式消解爐消解，升溫程序：70℃保持30 min，90℃保持30 min，120℃保持120 min，140℃保持60 min，之后120℃趕酸120 min。消解結(jié)束后將樣品定容至25 mL，并過濾至塑料小白瓶中保存，用原子吸收光度計(jì)測定Cu（Ⅱ）濃度。

1.6 傅里葉紅外光譜分析

將周叢生物、周叢生物+DOM以及DOM的樣品冷凍干燥，分別與干燥的光譜純級別的溴化鉀混合在瑪瑙研缽中研磨，然后壓片，再放入紅外光譜儀（Perkin Elmer Spectrum 65）中，于波長范圍4000～400 cm-1掃描得到紅外光譜圖，分辨率為4 cm-1。

1.7 高通量測序

按照DNA提取試劑盒（天根）相關(guān)步驟提取周叢生物總DNA，使用16SrDNA通用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGG）和 907R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）擴(kuò)增16SrRNA基因的V4～V5區(qū)（515～907）。PCR反應(yīng)混合物（20μL體積）包含4μL 5倍FastPfu反應(yīng)緩沖液、2μL dNTP混合物（2.5 mmol·L-1）、0.4μL每種引物（5μmol·L-1）、0.4μL FastPfu DNA聚合酶、10 ng模板DNA和ddH2O補(bǔ)足體積。

PCR熱循環(huán)方案設(shè)置為：在95℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入25個(gè)循環(huán)擴(kuò)增階段，每個(gè)循環(huán)包括變性95 ℃ 30 s，退火 54 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，最后于72℃保溫5 min。PCR擴(kuò)增在ABIGeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems，CA，USA）上進(jìn)行。使用2%（m/V）的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)一步純化。使用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）對純化的擴(kuò)增子進(jìn)行定量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq平臺上進(jìn)行高通量測序。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA，LSD），處理組和對照組的兩兩比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，單因素方差分析和T檢驗(yàn)中P值小于0.05均被認(rèn)為具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DOM添加量對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的影響

如圖1所示，隨著DOM添加量的增高，周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附容量不斷降低，當(dāng)DOM添加量為5%時(shí)，周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附容量比對照組減少了29.51%，而當(dāng)DOM添加量為10%、20%、30%時(shí)，周叢生物的吸附容量分別減少了63.54%、74.65%、80.21%。說明DOM對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）有抑制作用，且隨著DOM添加量的增高，抑制作用增強(qiáng)。

2.2 DOM對吸附動力學(xué)的影響

圖1 不同DOM添加量對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的影響Figure 1 Effects of different DOM addition levels on the adsorption of Cu（Ⅱ）by periphyton

如圖2所示，對照組和試驗(yàn)組的周叢生物吸附Cu（Ⅱ）在120 min之內(nèi)基本可以達(dá)到平衡。用準(zhǔn)一級動力學(xué)和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型進(jìn)行擬合后的參數(shù)見表1，周叢生物和加入DOM的周叢生物的準(zhǔn)一級動力學(xué)相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.889、0.869。而準(zhǔn)二級動力學(xué)模型擬合后，周叢生物和加入DOM的周叢生物的R2分別為0.958、0.927。根據(jù)相關(guān)性來判斷，兩組吸附試驗(yàn)結(jié)果都更符合二級動力學(xué)模型。周叢生物的理論最大吸附容量為0.417 mg·g-1，加入DOM的周叢生物理論最大吸附容量為0.229 mg·g-1，與實(shí)際結(jié)果相符。

2.3 不同Cu（Ⅱ）起始濃度條件下DOM對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的影響與等溫吸附特性

圖3為周叢生物在DOM添加量為5%的條件下和未加DOM的條件下對不同起始濃度的Cu（Ⅱ）吸附效果的擬合模型。由圖可見，周叢生物與加入DOM后的周叢生物吸附能力隨著Cu（Ⅱ）初始濃度的增大而增大，而且整體上加入DOM的周叢生物的吸附容量遠(yuǎn)小于純周叢生物的吸附容量。表2為等溫吸附擬合后所得出的相關(guān)參數(shù)。用Langmuir模型和Freundlich模型擬合純周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附數(shù)據(jù)顯示，擬合相關(guān)性均較高，相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.997和0.989。對于加入DOM的周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附，F(xiàn)reundlich模型擬合相關(guān)性系數(shù)為0.883，Langmuir模型擬合的相關(guān)性系數(shù)為0.953。純周叢生物的最大吸附容量為21.270 mg·g-1，加入DOM的周叢生物的最大吸附容量為7.594 mg·g-1。

圖2 周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附動力學(xué)曲線Figure 2 Adsorption kinetics of Cu（Ⅱ）by periphyton

表1 周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 1 Parametersof adsorption kinetics of Cu（Ⅱ）by periphyton（with or without DOM addition）fitted by Pseudo-First-order and Pseudo-Second-order models

表2 周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的Freundlich和Langmuir模型擬合參數(shù)Table 2 Adsorption isothermal parameters of Cu（Ⅱ）by periphyton fitted by Freundlich and Langmuir models

圖3 Freundlich和Langmuir模型擬合周叢生物對Cu（Ⅱ）的等溫吸附Figure 3 Adsorption isotherms of Cu（Ⅱ）by periphyton fitted by Freundlich model and Langmuir model

2.4 不同pH對吸附特性的影響

由圖4可以看出，pH對純周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的影響較為明顯，當(dāng)pH增大，酸性減弱時(shí)，純周叢生物的吸附容量逐漸增加。在pH從4升至8的過程中，純周叢生物吸附效果的變化十分明顯，吸附容量增加至2.04倍。而隨著pH的增大，加入DOM的周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附容量幾乎沒有變化。

2.5 解吸特性

以H2O、NH4NO3、EDTA-2Na三種解吸劑對周叢生物吸附的Cu（Ⅱ）進(jìn)行解吸。沒有添加DOM的純周叢生物中被H2O、NH4NO3、EDTA-2Na解吸的Cu（Ⅱ）分別為總吸附量的6.05%、53.58%、58.11%（圖5）。加入DOM的周叢生物用EDTA-2Na作解吸劑的結(jié)果為56.36%，與純周叢生物的結(jié)果相差不大，而用H2O和NH4NO3解吸的解吸率分別為12.60%和33.72%。

圖4 不同pH對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）特性的影響Figure 4 Effects of pH on the adsorption of Cu（Ⅱ）by periphyton

2.6 物料平衡

吸附前的周叢生物的消解測定結(jié)果顯示其中幾乎不含Cu（Ⅱ），所以表3和表4中僅顯示吸附和解吸后溶液與吸附后周叢生物中的Cu（Ⅱ）的含量。試驗(yàn)體系中Cu（Ⅱ）的添加量為0.15 mg，由表3、表4可以看出，周叢生物吸附的Cu（Ⅱ）與上清液中殘留的Cu（Ⅱ）含量之和可以達(dá)到物料平衡。

2.7 傅里葉紅外光譜表征

周叢生物、周叢生物+DOM以及DOM的傅里葉紅外光譜圖如圖6所示，周叢生物在872、1040、1382、1421 cm-1和3430 cm-1處有吸收峰，分別是不飽和烯烴、磷酸化合物以及羧酸根-COO-和-OH；DOM主要在1070、1382、1640 cm-1和3430 cm-1處有吸收峰，分別為磷酸化合物、羧酸根陰離子-COO-、酰胺基團(tuán)和-OH；周叢生物加入DOM后各個(gè)吸收峰無偏移，僅吸收強(qiáng)度有小幅變化，872、1040 cm-1和 1421 cm-1處對應(yīng)不飽和烯烴、磷酸化合物以及羧酸根-COO-的吸收峰小幅增強(qiáng)。

圖5 不同解吸劑對周叢生物和周叢生物+DOM解吸Cu（Ⅱ）的解吸率Figure5 Thedesorption ratesof Cu（Ⅱ）fromperiphyton or periphyton+DOMby different desorption agents

表3 不同DOM添加量試驗(yàn)中吸附前后的物料平衡（mg）Table 3 Material balance before and after adsorption with different DOM addition levels（mg）

2.8 周叢生物物種多樣性分析

圖6 周叢生物、周叢生物+DOM及DOM的傅里葉紅外光譜圖Figure 6 Fourier infrared spectra of periphyton，periphyton+DOM，and DOM

周叢生物中原核生物在門和屬水平上的相對豐度如圖7所示，在門分類水平上，按照占比從多到少依次為：藍(lán)藻門（Cyanobacteria）占55.74%、變形菌門（Proteobacteria）占28.39%、浮霉菌門（Planctomycetes）占6.20%、酸桿菌門（Acidobacteria）占2.80%、擬桿菌門（Bacteroidetes）占2.02%、綠彎菌門（Chloroflexi）占1.20%和未分類菌群（Others）占1.56%。由圖可以看出主要優(yōu)勢菌群為藍(lán)藻門（Cyanobacteria）。在屬分類水平上藍(lán)藻門中一個(gè)未鑒定的藍(lán)藻屬（unclassi-fied_c_Cyanobacteria）占30.53%，是其中的優(yōu)勢菌群。

表4 解吸附試驗(yàn)中解吸前后的物料平衡（mg）Table 4 Material balance before and after desorption in desorption experiment（mg）

圖7 周叢生物樣品中原核微生物的物種組成和相對豐度Figure 7 Prokaryotic species diversity of periphyton sample

3 討論

周叢生物對重金屬離子有較強(qiáng)的吸附去除能力，Liu等[26]的研究顯示，周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附去除效率為63%～73%。本研究的結(jié)果也表明，純周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附去除效率為58%～73%，與其研究的吸附效果相差不大，同時(shí)其研究中周叢生物大多為絲狀藻類和藍(lán)藻。本研究高通量測序結(jié)果顯示，周叢生物主要優(yōu)勢藻種為藍(lán)藻，而藍(lán)藻在生長過程中會分泌大量胞外聚合物[27]，這些胞外聚合物也富含大量的羧基、氨基、羥基及磷酸基團(tuán)等陰離子基團(tuán)[28]，周叢生物的紅外基團(tuán)分析的結(jié)果也與此吻合。本吸附試驗(yàn)研究結(jié)果表明，牛糞來源的DOM可以抑制周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附，且隨著DOM添加量的增高抑制效果也增加。紅外基團(tuán)分析結(jié)果顯示，牛糞來源的DOM主要含有羧基、酰胺基團(tuán)、羥基等陰離子基團(tuán)。羧基、羥基、羰基和氨基等活性基團(tuán)能夠與Cu（Ⅱ）形成二元配合物[29]，從而影響Cu（Ⅱ）在水中的遷移。有研究表明，DOM只與Cu（Ⅱ）形成二元配合物，不會繼續(xù)和藻類表面形成三元絡(luò)合物[30]。據(jù)此推測，牛糞來源的DOM會和周叢生物競爭吸附Cu（Ⅱ），從而導(dǎo)致DOM抑制周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附。

Langmuir吸附模型多適用于單層吸附，F(xiàn)reundlich吸附模型多適用于多層吸附[31]。本研究等溫吸附擬合結(jié)果顯示，純周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附用Langmuir模型和Freundlich模型擬合的相關(guān)系數(shù)都較高，而加入DOM后，Langmuir模型擬合的相關(guān)性系數(shù)要高于Freundlich模型，說明吸附體系加入DOM后降低了周叢生物吸附Cu（Ⅱ）的異質(zhì)性。

解吸劑H2O、NH4NO3、EDTA-2Na能分別解吸吸附劑通過物理吸附、離子交換和離子絡(luò)合作用吸附的金屬離子[32-33]。本研究的解吸結(jié)果顯示純周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附方式主要是離子交換，加入DOM后的周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附主要是離子交換和表面絡(luò)合。

吸附劑通過離子交換的方式吸附金屬離子的能力受吸附體系pH的影響較大。當(dāng)吸附體系pH較低時(shí)，細(xì)胞壁上的活性基團(tuán)和水化氫離子（H3O+）緊緊結(jié)合在一起，從而限制金屬離子的接近，影響吸附效果[34]。而在一定的pH值范圍內(nèi)，當(dāng)pH逐漸升高時(shí)，更多的反應(yīng)基團(tuán)會帶負(fù)電，可以吸附更多帶正電的金屬離子。本研究的解吸試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加DOM后，周叢生物通過離子交換吸附的方式吸附的Cu（Ⅱ）大幅降低，這也許是添加DOM后周叢生物對Cu（Ⅱ）的吸附受pH值影響較小的原因。

4 結(jié)論

（1）牛糞DOM含有大量的羥基、羧基、磷酸基團(tuán)，對周叢生物吸附Cu（Ⅱ）有競爭抑制效應(yīng)，且隨著DOM添加量的增高抑制效果增加，當(dāng)DOM添加量為30%時(shí)，周叢生物的吸附容量減少了80.21%。

（2）純周叢生物對Cu（Ⅱ）吸附主要通過離子交換和絡(luò)合吸附的方式進(jìn)行，而加入DOM后離子交換吸附比率降低，表面絡(luò)合吸附比率增加了18.11%。