沙亞東，蔣楨蕓，蘇冬云，周德生，張 軍，袁 濤，申哲民*

（1.上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240；2.上海市市容環(huán)境運(yùn)輸處有限公司，上海 200060；3.上海老港廢棄物處置有限公司，上海 201302）

作為一種廣譜殺蟲除草劑，有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides，OPs）被廣泛用于控制我國和世界其他地區(qū)的農(nóng)業(yè)害蟲[1]，確保農(nóng)作物的正常生長。OPs在全球有300～400個品種，其殺蟲譜廣、藥效好，已經(jīng)成為殺蟲劑市場最重要的部分。廣泛使用的OPs及其普遍偏低的農(nóng)藥利用率[2]，使其在土壤中大量殘余。土壤中存在的OPs會通過灌溉水下滲或大氣降水等過程，遷移進(jìn)入到水生生態(tài)系統(tǒng)中。相比于有機(jī)氯農(nóng)藥，OPs曾因其易降解性和較強(qiáng)的親水性而被認(rèn)為是一類安全高效的農(nóng)藥[3]。然而后來研究發(fā)現(xiàn)，OPs能夠在水環(huán)境中持久存在，近年來，OPs在我國和其他國家的沉積底泥中被大量檢出。Lan等[4]在我國東海的沉積底泥里檢出三唑磷含量范圍為nd～32.10 ng·g-1；Wu等[5]在巢湖底泥中檢出OPs總量范圍為0.27～23.33 ng·g-1；Akoto等[6]在加納河流中檢出甲基嘧啶磷的含量范圍為0.01～0.17 μg·g-1。OPs的基本作用機(jī)制是能夠通過皮膚接觸、食品食用和呼吸吸入等途徑進(jìn)入人體，從而抑制乙酰膽堿酯酶，使乙酰膽堿積聚，危害神經(jīng)系統(tǒng)[7]，長期食用或接觸含有OPs殘留物的物質(zhì)，會造成慢性中毒。OPs對人類健康造成了極大的威脅，全世界范圍內(nèi)每年就有數(shù)百萬個OPs中毒案例[8]。

目前關(guān)于OPs污染土壤修復(fù)的研究較多，常見的修復(fù)方法包括熱脫附法[9]、微生物法[10]和高級氧化法[11]等。但是關(guān)于OPs污染底泥的修復(fù)研究很少，例如Amaya等[12]利用香蒲對含有甲基對硫磷的污染底泥進(jìn)行修復(fù)，14 d內(nèi)88%的甲基對硫磷被去除。

針對目前處理底泥OPs污染研究較少的情況，本試驗采用微生物降解技術(shù)進(jìn)行底泥OPs去除研究。目前，底泥中微生物降解技術(shù)的運(yùn)用主要以消除底泥黑臭[13-14]以及去除多環(huán)芳烴[15-16]等持久性有機(jī)污染物為主，該技術(shù)的原理是利用細(xì)菌、真菌等微生物以底泥中的污染物作為營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，從而達(dá)到去除有機(jī)污染、修復(fù)污染底泥的目的[17]。土工布袋是利用聚合化纖合成材料制成的袋狀產(chǎn)品，工程上用混凝土或砂漿灌入袋中，待其固結(jié)達(dá)到一定強(qiáng)度后，用于沿海海岸和河道的護(hù)坡。本研究以O(shè)Ps模擬污染底泥為研究對象，首次采用土工布袋作為其降解反應(yīng)發(fā)生的容器，主要采用好氧菌群和厭氧菌群兩類微生物混合菌劑對OPs進(jìn)行降解。研究了不同菌群降解污染底泥的反應(yīng)動力學(xué)和半衰期，并計算了馬拉硫磷、喹硫磷、二嗪磷和樂果4種OPs污染物分子的最低空軌道能（ELUMO）、分子的最高占據(jù)軌道能（EHOMO）和兩者的差值EGAP（EGAP=ELUMO-EHOMO）這3種量化參數(shù)，從分子的微觀結(jié)構(gòu)對降解行為進(jìn)行解釋，并探究利用土工布袋實現(xiàn)OPs污染底泥資源化再利用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用揚(yáng)州海誠生物生產(chǎn)的兩類混合菌劑，分別為好氧菌菌劑和厭氧菌菌劑。兩種微生物菌劑均是將篩選的菌株培養(yǎng)后與載體、保護(hù)劑復(fù)合而成。其中：載體為沸石灰；保護(hù)劑為1%（m/V）的海藻酸鈉；好氧菌菌劑主要包括不動桿菌屬、芽孢桿菌屬、酵母菌屬等，厭氧菌菌劑主要包括產(chǎn)甲烷菌屬、假單胞菌屬、乳酸菌屬等，有效活菌為200億·kg-1。

1.1.2 供試底泥

試驗所用的底泥取自上海交通大學(xué)閔行校區(qū)思源湖。采用彼得森采泥器進(jìn)行采集，采泥厚度為10.00～15.00 cm。底泥經(jīng)分析測試，不含有此次試驗研究的4種OPs污染物，底泥的其他理化性質(zhì)見表1。

1.1.3 試驗儀器和試劑

試驗儀器：冷凍干燥儀（北京亞星儀科）；ThermoScientificTMDionexTMASETM350加速溶劑萃取裝置（美國Thermo公司）；Turbo Vap多功能全自動濃縮儀（瑞典Biotage公司）；QP-2020型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）。

表1 供試底泥的部分理化性質(zhì)Table 1 Partial physical and chemical properties of the test sediment

試驗試劑：喹硫磷（分析純）、二嗪磷（分析純）、樂果（分析純）均購于北京伊諾凱科技有限公司；馬拉硫磷（分析純）購于上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；丙酮（色譜純）和二氯甲烷（色譜純）購于國藥集團(tuán)。

1.2 加速溶劑萃取與GC-MS操作條件

加速溶劑萃取條件：萃取溶劑為丙酮和二氯甲烷（1∶1，V/V）；萃取溫度80 ℃；萃取壓力10.34 MPa；靜態(tài)萃取時間10 min；沖洗體積60%；靜態(tài)萃取3次。

色譜條件：載氣為高純氦氣；流速1 mL·min-1；色譜柱程序升溫為初溫95℃，保持15 min，然后以20℃·min-1升至190℃，再以5℃·min-1升至230℃，最后以25℃·min-1升至250℃并保持5 min；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1μL。

工程項目勞務(wù)管理部門應(yīng)根據(jù)企業(yè)的有關(guān)制度，在符合工程所在國家相關(guān)法律體系的基礎(chǔ)上，合理配置工程施工中各工作崗位的人數(shù)，并將工程項目的實際人工成本、超支情況及目標(biāo)控制狀況等方面的內(nèi)容與計劃內(nèi)容相對比。并且，從中分析出國際工程勞務(wù)本土化管理中存在的問題、掌握管理重點，提高人工成本管理的整體水平[4]。同時，在制定項目人工成本核算考核目標(biāo)的過程中，應(yīng)注意以下幾個方面：首先，明確管理目標(biāo)，建立完善的管理體系，并落實責(zé)任制，制定科學(xué)的人工成本核算制度。其次，項目管理單位應(yīng)針對工程施工中的每一施工作業(yè)環(huán)節(jié)，制定管理標(biāo)準(zhǔn)，合理調(diào)節(jié)勞動力，將多余的勞動力調(diào)整到有需要的區(qū)域，提高工作效率。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，離子溫度230℃，四極桿溫度150℃，質(zhì)量掃描70～350μL，溶劑延遲3 min，采用選擇離子方式（SM）檢測。

1.3 模擬污染底泥的配制

將馬拉硫磷、喹硫磷、二嗪磷和樂果試劑溶于丙酮溶液，配制成4種OPs濃度均為0.50 mg·mL-1的混合溶液，保存于4℃冰箱內(nèi)備用。將采集的底泥風(fēng)干后研磨過2.00 mm篩網(wǎng)，將配制的OPs混合溶液稀釋至0.05 mg·mL-1。取200 g過篩底泥于燒杯內(nèi)，將底泥和200 mL稀釋的含有4種OPs的丙酮溶液（0.05 mg·mL-1）進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，之后將底泥置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)，風(fēng)干48 h待丙酮完全揮發(fā)后，得到4種OPs污染濃度均為50.00 mg·kg-1的模擬污染底泥。將模擬污染底泥放于棕色瓶中，保存于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 微生物的投加

取200.00 g模擬污染底泥，加入800.00 g水充分?jǐn)嚢瑁誓酀{狀后，測得含水率為85.70%，將其裝入長20.00 cm、寬15.00 cm的聚丙烯土工布袋中。試驗分為3組，每組3個平行樣：第一組，每個投加0.50 g好氧菌菌劑；第二組，每個投加0.50 g厭氧菌菌劑；第三組為空白組。投入菌劑后充分?jǐn)嚢?，將土工布袋封住，放置于陰涼避光處保存?/p>

1.5 分析方法

含水率的測定：從土工布袋底泥內(nèi)部取部分底泥，稱取質(zhì)量后放入烘箱內(nèi)，在105℃下烘干4 h至恒

式中：η為OPs降解率，%；C0為OPs的初始濃度，mg·kg-1；Ct為 t時刻OPs的濃度，mg·kg-1。

1.6 方法質(zhì)量控制

本試驗采用風(fēng)干后過篩的底泥，用1.3的方法分別配制4種OPs加標(biāo)量均為2.50 mg·kg-1和25.00 mg·kg-1的樣品，每種樣品均按分析方法做6次平行樣。在高濃度和低濃度下，4種OPs的加標(biāo)回收率均大于80.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，不影響定量分析。

1.7 量子化學(xué)參數(shù)計算方法

本研究采用量子化學(xué)計算軟件Materials Studio 7.0將4種OPs的結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，運(yùn)用DMol3模塊中的梯度近似方法（B3LYP），對化合物分子的最低空軌道能（ELUMO）、最高占據(jù)軌道能（EHOMO）和兩者的差值EGAP（EGAP=ELUMO-EHOMO）進(jìn)行計算。質(zhì)量后，稱取底泥的質(zhì)量，計算其對應(yīng)的含水率。

OPs含量的測定：從底泥內(nèi)部取部分底泥，冷凍干燥后，研磨過1.00 mm篩網(wǎng)，稱取2.00 g過篩底泥于萃取池內(nèi)，進(jìn)行加速溶劑萃取；萃取結(jié)束后，將所得萃取液在40℃下氮吹至近干，用二氯甲烷定容至1.00 mL，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶內(nèi)進(jìn)行GC-MS定量檢測，計算微生物對4種OPs的降解率，降解率的計算公式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種菌群對OPs污染底泥的脫水與降解效果

在土工布袋內(nèi)，原含水率為85.70%的模擬污染底泥，經(jīng)過25 d后，投入菌劑的污染底泥的含水率分別為3.81%（好氧菌群）和2.93%（厭氧菌群），低于不投加菌劑的空白組的含水率4.38%（P＜0.05）。試驗結(jié)果表明，將底泥裝入土工布袋內(nèi)能夠使底泥的含水率在一段時間內(nèi)迅速降低，脫水效果顯著。

在實驗室模擬條件下，好氧菌群和厭氧菌群降解模擬污染底泥中OPs的結(jié)果如圖1所示。培養(yǎng)25 d后，好氧菌群和厭氧菌群對濃度均為50.00 mg·kg-1的OPs的降解效果總體差異不大。兩種菌群對馬拉硫磷和喹硫磷的降解率均高于90.00%，其中，好氧菌群對喹硫磷的降解率達(dá)到93.78%。本次試驗所用的好氧菌群混合菌劑中含有的芽孢桿菌屬是我國棉田中喹硫磷的主要降解菌種，喹硫磷在芽孢桿菌屬作用下的主要降解產(chǎn)物為C8H6N2O、C8H6N2O2S和C4H11O3PS[18]。厭氧菌群對樂果的降解效果高于好氧菌群，在25 d后樂果對厭氧菌群的降解率為83.84%。農(nóng)藥的微生物降解作用實際上是酶促反應(yīng)，微生物本身含有或者能夠產(chǎn)生可降解該農(nóng)藥的酶系基因[19]，厭氧菌群中微生物可能產(chǎn)生了能夠打開樂果P-S鍵的磷酸酶，從而獲得了對樂果更高的降解效率[20]。兩類菌群對二嗪磷的降解效果較低，只有60.91%（好氧菌群）和61.50%（厭氧菌群）。不投加任何菌劑的空白樣中，4種OPs的降解率均低于25.00%。試驗表明，向土工布袋內(nèi)投加菌劑來降解袋內(nèi)OPs污染底泥具有良好的效果。

圖1 兩種菌群對OPs的降解效果Figure 1 Degradation effect of two kinds of flora on OPs

2.2 好氧菌群對OPs的降解動力學(xué)

好氧菌群降解OPs的時間-含量曲線見圖2。1～5 d內(nèi)，OPs的降解速度緩慢，這可能是由于高濃度的底物抑制了微生物的活性，影響了酶促反應(yīng)的進(jìn)行，從而限制了微生物對污染物的降解[21]；同時，OPs具有較大的生物毒性，會對菌體的生長造成影響，好氧菌群對OPs污染物需要一定的適應(yīng)時間。段海明等[22]對OPs污染物甲基對硫磷的微生物降解研究中也發(fā)現(xiàn)，菌株能夠高效降解相對較低濃度的甲基對硫磷，但對高濃度的甲基對硫磷降解率較低。5～10 d，OPs的濃度顯著降低，其中喹硫磷的濃度下降了32.36%，馬拉硫磷的濃度降低了39.36%，這可能是由于好氧菌群適應(yīng)OPs濃度后快速繁殖，菌體和OPs充分接觸，使得更多的污染物被降解。10～25 d，OPs的降解速度緩慢并逐漸達(dá)到平衡，這是由于密封的土工布袋內(nèi)氧氣逐漸減少，部分好氧菌因缺氧以及營養(yǎng)物質(zhì)的缺失而死亡。

圖2 好氧菌群降解4種OPs（50 mg·kg-1）的時間-含量曲線Figure 2 Time-content profile for the degradation of four OPs（50 mg·kg-1）by aerobic bacteria

根據(jù)圖2進(jìn)行擬合，可得到好氧菌群對OPs的降解動力學(xué)擬合方程和半衰期，結(jié)果見表2。好氧菌群降解OPs的動力學(xué)與一級動力學(xué)擬合效果良好，各處理R2均大于0.90。4種OPs在土壤中的自然降解半衰期分別為3.50 d（馬拉硫磷）、21 d（喹硫磷）、40 d（二嗪磷）和22 d（樂果）[23]。由表2可見，由于好氧菌群混合菌劑的加入，喹硫磷、二嗪磷和樂果的半衰期都明顯縮短，而馬拉硫磷的半衰期延長了2.38 d。土壤中農(nóng)藥的半衰期取決于農(nóng)藥類型、土壤類型、菌體種類、土壤pH和溫度等多個條件，馬拉硫磷半衰期延長的原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3 厭氧菌群對OPs的降解動力學(xué)

在實驗室模擬條件下，厭氧菌群降解OPs的過程如圖3所示。0～5 d內(nèi)，高濃度的OPs對厭氧菌群產(chǎn)生了一定的抑制作用。其中，馬拉硫磷和二嗪磷在5 d內(nèi)的降解率均低于10%，低于好氧菌群同期的降解效果。5～25 d內(nèi)，厭氧菌群對新環(huán)境逐漸適應(yīng)，降解OPs的速率有所提高，厭氧菌群在每個階段降解OPs的速率差異不大。最終降解率：馬拉硫磷（96.64%）＞喹硫磷（92.13%）＞樂果（83.84%）＞二嗪磷（61.50%）。由表3可見，厭氧菌群降解OPs的動力學(xué)與一級動力學(xué)擬合良好，這與好氧菌群一致。4種OPs污染物在厭氧菌群的降解作用下半衰期縮短得更多（馬拉硫磷除外），這可能是由于密封的土工布袋內(nèi)缺氧的環(huán)境更利于厭氧菌群的生長。利用厭氧菌降解土壤中OPs污染物的研究較少，Zhang等[24]采用乳酸菌對脫脂乳中的OPs進(jìn)行降解研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌使二嗪磷的降解速度提高了225.40%，使馬拉硫磷的降解速度提高了29.70%，相對于馬拉硫磷，二嗪磷更穩(wěn)定，不易被降解。同樣，在本試驗中，二嗪磷的降解率也低于馬拉硫磷。

表2 好氧菌群降解OPs的動力學(xué)擬合方程Table 2 Kinetic fitting resultsfor the degradation of four OPs（50 mg·kg-1）by aerobic bacteria

2.4 OPs降解水平的機(jī)理研究

在好氧菌群和厭氧菌群對4種OPs污染物的降解試驗中，二嗪磷和樂果的降解效果均低于馬拉硫磷和喹硫磷，對此本研究通過計算4種化合物的分子結(jié)構(gòu)參數(shù)對其進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。ELUMO、EHOMO和兩者的差值EGAP是軌道前線理論里重要的描述符。前線軌道認(rèn)為，分子的最低空軌道能（ELUMO）是分子得到電子能力的量度，ELUMO越低，分子接受電子的能力越強(qiáng)；分子的最高占據(jù)軌道能（EHOMO）是分子給電子能力的量度，EHOMO越低，軌道中電子越穩(wěn)定，分子給電子能力越弱；兩者的差值EGAP是分子穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，EGAP值越大，分子的穩(wěn)定性越強(qiáng)，越不容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[25]。

圖3 厭氧菌群降解4種OPs（50 mg·kg-1）的時間-含量曲線Figure 3 Time-content profile for the degradation of fourOPs（50 mg·kg-1）by anaerobic flora

圖4 是4種OPs的ELUMO、EHOMO和EGAP值的情況，4種OPs污染物的EGAP值大小為二嗪磷＞樂果＞馬拉硫磷＞喹硫磷。二嗪磷的EGAP值最大，性質(zhì)最穩(wěn)定，最不容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，這與本研究的結(jié)果相對應(yīng)，即4種OPs污染物中，二嗪磷在兩類菌群的降解試驗中，降解率均為最低。

3 結(jié)論

（1）好氧菌和厭氧菌菌劑在25 d內(nèi)均能有效降解OPs，且降解效果差異不大。除二嗪磷外，兩種菌劑對馬拉硫磷、喹硫磷、樂果的降解率均在75.00%以上。兩種菌劑降解OPs的降解動力學(xué)均與一級動力學(xué)方程擬合良好。除馬拉硫磷外，其余3種OPs污染物的半衰期明顯縮短。

圖4 4種OPs的E LUMO、E HOMO和E GAP值Figure 4 E LUMO，E HOMO and E GAP value of four OPs

表3 厭氧菌群降解OPs的動力學(xué)擬合方程Table 3 Kinetic fitting results for the degradation of four OPs（50 mg·kg-1）by anaerobic flora

（2）二嗪磷的EGAP值最高，性質(zhì)最穩(wěn)定，最不易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，這可能是二嗪磷在兩類菌劑的作用下降解率均為最低的原因。該研究結(jié)果提示，量化參數(shù)可能有助于從分子結(jié)構(gòu)角度解釋OPs生物降解的難易程度。

（3）在土工布袋內(nèi)進(jìn)行底泥修復(fù)試驗，能夠顯著降低袋內(nèi)底泥的含水率和農(nóng)藥污染程度，滿足土工布袋的工程化要求，這一研究為疏浚底泥的處理和資源化再利用提供了新的思路，也為今后的工程應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。但是，本研究是在實驗室人工設(shè)定的試驗條件下進(jìn)行的，這與實際的工程應(yīng)用有較大差異。此外，降解OPs的最適菌種和降解條件還有待進(jìn)一步研究。