葉世豪，沈 琦，李園成，孫 宏，姚曉紅，吳逸飛，王 新，李維琳，湯江武*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，杭州 310021）

隨著我國生豬養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的大量糞便和污水對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。作為一種將生豬養(yǎng)殖與發(fā)酵床分開的綠色生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)，異位發(fā)酵床技術(shù)能從源頭上實(shí)現(xiàn)糞便和污水的零排放，極大降低對環(huán)境的污染[1]。但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用過程中，礱糠、木屑等常規(guī)墊料原材料的需求量巨大但又地域分布不均，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)成本較大[2]。

作為農(nóng)業(yè)大國，我國每年產(chǎn)生大量的秸稈農(nóng)業(yè)廢棄物；在我國廣大的農(nóng)村地區(qū)，秸稈的傳統(tǒng)處理方法是在田間隨意堆放或直接燃燒，這不僅造成了環(huán)境污染，而且導(dǎo)致秸稈中營養(yǎng)成分的損失[3]。若以農(nóng)業(yè)秸稈作為墊料進(jìn)行糞污的異位發(fā)酵床處理[4]，并通過好氧高溫發(fā)酵腐熟形成生物肥料，既可以實(shí)現(xiàn)糞尿和秸稈無害化處理和資源化利用，又能降低發(fā)酵床的成本。

墊料中的微生物群落對于發(fā)酵床的發(fā)酵進(jìn)程起到?jīng)Q定性作用，是發(fā)酵床的研究重點(diǎn)。趙國華等[5]利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法研究了發(fā)酵床墊料中的微生物群落多樣性。但墊料中可培養(yǎng)微生物不到1%，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)難以了解發(fā)酵進(jìn)程中功能微生物的群落組成和演替。鄭雪芳等[6]通過磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法研究生豬發(fā)酵床發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵程度越深，墊料的微生物群落結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。隨著高通量技術(shù)發(fā)展，其能夠全面、快速地檢測發(fā)酵進(jìn)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化并分析優(yōu)勢菌群的動(dòng)態(tài)分布。陳倩倩等[7]基于宏基因組方法分析出夏季發(fā)酵床細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比冬季更加豐富?；潞Ａ盏萚8]發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長墊料中硝態(tài)氮的含量顯著增加，同時(shí)功能微生物豐度顯著降低。發(fā)酵床墊料微生物的研究多側(cè)重于不同發(fā)酵階段的微生物演替，而關(guān)于不同秸稈墊料微生物群落及優(yōu)勢菌群的動(dòng)態(tài)卻少有研究。本研究以不同的秸稈墊料異位發(fā)酵床為研究對象，通過高通量測序技術(shù)研究發(fā)酵進(jìn)程中微生物菌群的豐度和優(yōu)勢菌群變化，結(jié)合墊料理化指標(biāo)分析，為探索發(fā)酵床秸稈墊料合理組合和墊料微生物的演替規(guī)律提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

墊料組成成分：木屑、礱糠（稻殼）、油菜秸稈和水稻秸稈粉碎成0.5～2 cm小段。發(fā)酵床菌劑：本實(shí)驗(yàn)室自研發(fā)菌劑[9]；試驗(yàn)用豬糞取自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豬場。本研究將粉碎后的墊料成分按油菜秸稈或水稻秸稈∶木屑∶礱糠=2.5∶3∶4.5的體積比混合成體積為3 L的墊料組合，將其添加到發(fā)酵容器中（直徑15 cm，高20 cm，體積3.50 L），并設(shè)置木屑∶礱糠=4∶6的體積比例墊料作為對照，每個(gè)組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)組別設(shè)置見表1。糞污添加量按實(shí)際生產(chǎn)中異位發(fā)酵床消納量成比例縮小[9]，在第0、3、6、9、12 d添加200 g豬糞污并手動(dòng)攪拌均勻，并維持墊料的初始含水率為50%～60%。

表1 試驗(yàn)組別設(shè)置Table 1 Experimental group setting

1.2 墊料理化指標(biāo)測定方法

每日定時(shí)測定發(fā)酵床中心處溫度。在發(fā)酵過程的12 d中，分別在第0、3、6、9 d和12 d對3個(gè)重復(fù)組采樣并-20℃保存，采樣前要將墊料攪拌均勻。通過文獻(xiàn)[10-11]中的方法測定pH值、水分含量（MC）、EC值。銨態(tài)氮采用水楊酸-次氯酸鹽分光光度法測定[12]，硝態(tài)氮采用氯化鉀浸提-紫外分光光度法測定[13]。有機(jī)質(zhì)碳用重鉻酸鉀容量法測定[14]，總氮含量通過AJ分析儀MULTIN/C3100測定。

1.3 細(xì)菌群落總DNA的提取及高通量測序

取低溫冷藏的樣品，使用QIEGENDNeasy Power-Soil kit試劑盒提取DNA，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對DNA進(jìn)行定量。采用原核生物16SrRNA基因V3-V4區(qū)引物338F（5'-ACT CCT ACGGGA GGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'）對各墊料樣本總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。目的條帶大小正確，則進(jìn)行上機(jī)測序。測序系統(tǒng)為Illumina MiSeq平臺(tái)，測序公司為上海派森諾生物科技有限公司。

1.4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

通過高通量測序后，利用FLASH軟件（v1.2.7）對原始序列進(jìn)行過濾組合。隨后，通過QIIME軟件（v1.8.0）調(diào)用USEARCH（v5.2.236）檢查并剔除嵌合體序列。使用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST這一序列比對工具對前述獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，對于每個(gè)OTU的代表序列，在QIIME軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，通過將OTU代表序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對，獲取每個(gè)OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。使用QIIME軟件分別對每個(gè)樣本計(jì)算ACE、Chao1、Shannon和Simpson等多樣性指數(shù)。使用QIIME軟件，獲取各樣本在門、綱、目、科、屬分類水平上的組成和豐度分布表，并通過柱狀圖呈現(xiàn)分析結(jié)果。16S功能預(yù)測是通過PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）將現(xiàn)有的16SrRNA基因測序數(shù)據(jù)與KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）、COG（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）和 Rfam（http：//rfam.xfam.org）功能譜數(shù)據(jù)庫相對比，從而實(shí)現(xiàn)對微生物群落代謝功能的預(yù)測。通過使用Canoco for Windows（版本4.5）的冗余分析（RDA）技術(shù)分析了細(xì)菌群落與環(huán)境參數(shù)之間的關(guān)系。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

使用WPS2019進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理作圖，SPSS 21.0進(jìn)行方差分析，分析方法為Tukey多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 異位發(fā)酵床進(jìn)程中墊料理化指標(biāo)變化

圖1（a）為不同墊料組合異位發(fā)酵床發(fā)酵12 d進(jìn)程中墊料的溫度變化。在發(fā)酵初期，Y組和S組相比CK升溫更加迅速且升溫更高，第2 d Y組就達(dá)到最高溫度53℃；從第2 d開始進(jìn)入嗜溫期，Y組和CK組在40～55℃的嗜熱階段均維持了8 d，且Y組最高溫度達(dá)53℃，且有2 d在50℃以上，而CK組溫度一直在50℃以下；從第9 d開始，3組溫度逐漸下降到環(huán)境溫度。綜上研究發(fā)現(xiàn)，Y組升溫更加迅速，最高溫度更高，嗜溫期更長。圖1（b）為3組0～12 d發(fā)酵進(jìn)程中墊料水分含量變化。CK、Y、S3組墊料初始含水率分別為41.71%、41.63%和43.69%，隨著發(fā)酵的進(jìn)行CK組和Y組墊料含水率不斷上升，而S組先上升，到第6 d后有所下降，到第12 d時(shí)，CK、Y、S組墊料含水率分別為47.94%、49.90%、45.25%。

圖1（c）顯示在發(fā)酵初期，3組墊料的pH都呈弱酸性，隨著發(fā)酵的進(jìn)行3組的pH不斷升高，S組pH上升速率最快，Y組次之，CK組最慢。發(fā)酵到第12 d時(shí)，CK組的pH為8.47，Y組pH為8.22，S組pH為8.46。本研究進(jìn)程中，3組pH都保持在5.5～8.5這一范圍內(nèi)。電導(dǎo)率（EC）可以反映墊料中可溶性總鹽的含量，如圖1（d）所示，墊料中的EC值先有所上升然后緩慢下降，發(fā)酵進(jìn)行到第12 d時(shí)CK組EC值為2050μS·cm-1，Y組EC值為2110 μS·cm-1，S組EC值為1640μS·cm-1。添加水稻秸稈、油菜秸稈的墊料組合EC值一直保持較低水平。

如圖1（e）所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，墊料中銨態(tài)氮含量不斷增加，在第9 d到達(dá)最高值后開始下降；CK組銨態(tài)氮含量最高達(dá)40.64 mg·L-1，Y組最高36.91 mg·L-1，S組最高為37.13 mg·L-1；第 12 d 3組銨態(tài)氮值分別下降到 33.68、28.75、30.27 mg·L-1。從圖 1（f）中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵開始?jí)|料中硝態(tài)氮含量在不斷升高，但升高速率較緩慢并在第6 d有下降的趨勢；第12 d CK、Y、S組硝態(tài)氮含量分別達(dá)到7.84、8.30、8.25 mg·L-1，其中Y組硝態(tài)氮含量最高，CK組硝態(tài)氮含量最低。

微生物活動(dòng)必須有碳源和氮源，C/N是發(fā)酵進(jìn)程中重要的影響因素。如圖2所示，不同墊料組合發(fā)酵床的C/N比值隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降的趨勢。第0 d時(shí)CK、Y、S組C/N分別為29.76、26.07、26.52，第12 d時(shí) C/N 分別為 23.97、19.94、20.77，分 別 降低了19.45%、23.50%、21.65%。

2.2 不同墊料組合發(fā)酵床進(jìn)程中微生物群落多樣性分析

為研究不同墊料組合異位發(fā)酵床中不同時(shí)期微生物群落組成變化和相互之間的差異，對獲得的墊料微生物序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。圖3為不同墊料組合異位發(fā)酵床不同時(shí)期OTU劃分和分類地位鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果，從圖中可以明顯看出3種墊料組合中微生物的OTU數(shù)量在不同分類水平上的差異。CK組不同時(shí)期的OTU數(shù)量要明顯低于S組和Y組，其中Y12的OTU數(shù)量最高，達(dá)到7409。與第3 d相比，第12 d S組的OTU數(shù)量減少了566，CK組減少了1042，而Y組增加了444。

圖1 不同墊料組合異位發(fā)酵床發(fā)酵進(jìn)程中墊料溫度、水分、pH、EC及銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的變化Figure 1 The changes of temperature,moisture,pH,electrical conductivity and the content of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in the fermentation process of different litter combination EFSs

Chao1或ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。Simpson或Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。Simpson多樣性指數(shù)是評(píng)價(jià)群落多樣性的常用指數(shù)之一。一般而言，Shannon指數(shù)對群落的豐富度以及稀有OTU更敏感，而Simpson指數(shù)對均勻度和群落中的優(yōu)勢OTU更敏感。3種不同墊料組合中菌群微生物多樣性分析結(jié)果見表2。不同墊料組合第12 d的Chao1或ACE指數(shù)與發(fā)酵初期第3 d相比都在降低，其中CK組Chao1和ACE指數(shù)分別降低了25.39%和25.23%，Y組分別降低了3.04%、3.30%，S組分別降低了7.58%、10.57%。從表中可以發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中，3組的Simpson指數(shù)在0.948 595～0.982 598之間，第6、9、12 d的Shannon指數(shù)CK組要明顯低于S組和Y組。

2.3 不同墊料組合發(fā)酵床進(jìn)程中的微生物群落組成

根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，可以獲得每個(gè)樣本在各分類水平的具體組成。選取分類水平上豐度排名前21位的門和屬繪制豐度柱形圖。如圖4（a）所示，墊料主要菌群由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）等組成。其中，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門合計(jì)占總豐度的96.5%，占據(jù)絕對的優(yōu)勢地位。變形菌門的相對豐度在發(fā)酵進(jìn)程中呈下降的趨勢，其中CK組降低了75%，S組降低了38%，Y組降低了23.2%。

圖2 不同墊料組合異位發(fā)酵床發(fā)酵進(jìn)程的C/N變化Figure 2 C/Nchanges during fermentation of different litter combination EFSs

圖3 不同墊料組合異位發(fā)酵床不同時(shí)期OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Figure 3 Statistical diagramof OTUclassification and classification status identification results of different litter combination EFSs in different periods

從圖4（b）中看出，在屬的分類水平上不同發(fā)酵時(shí)期優(yōu)勢菌群在不斷變化。嗜溫期主要的屬有芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鞘銨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。其中，CK組芽孢桿菌屬相對豐度最高為36.8%，乳桿菌屬最高為12.9%，假單胞菌屬最高為3.8%；S組芽孢桿菌屬相對豐度最高為16.9%，乳桿菌屬最高為8.1%，假單胞菌屬最高為9.8%；Y組芽孢桿菌屬相對豐度最高為40.5%，乳桿菌屬最高為6.5%，假單胞菌屬最高為6.1%。從圖4（b）可發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的不斷深入，能引起細(xì)菌感染的菌屬的相對豐度大幅降低。從發(fā)酵第3 d到第12 d，CK組中克雷伯氏菌屬（Klebsiella）由28.7%下降到0.4%，腸桿菌屬（Enterobacter）由40.8%下降到0，大腸桿菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）由7.9%下降到0.1%；而S組克雷伯氏菌屬由13.6%下降到0.2%，腸桿菌屬由12.1%下降到0.4%，大腸桿菌屬-志賀氏菌屬由4%下降到0.1%；Y組克雷伯氏菌屬由36.9%下降到0.7%，腸桿菌屬由29.3%下降到1.7%，大腸桿菌屬-志賀氏菌屬由9.3%下降到0.3%。

表2 菌群微生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity index

2.4 異位發(fā)酵床功能微生物代謝相關(guān)基因的差異

根據(jù)PICRUSt預(yù)測3種不同墊料組合異位發(fā)酵床主要有機(jī)物降解途徑，分析細(xì)菌群落對脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因拷貝數(shù)的差異性。在整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中，3組中不同的代謝相關(guān)基因變化相似，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因拷貝數(shù)不斷減少呈下降趨勢（圖5）；從發(fā)酵第3 d到第12 d，脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因拷貝數(shù)CK組減少了65.82%、69.95%、76.73%，Y組減少了42.88%、45.52%、60.31%，S組減少了39.87%、41.73%、57.72%。第3 d脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因拷貝數(shù)最高，其中CK組分別為2 099 003、6 235 987、7 890 496，Y組分別為2 108 131、6 248 879、8 032 987，S組分別為1 950 342、5 776 472、7 447 289；3組不同墊料組相比，Y組3種代謝相關(guān)基因拷貝數(shù)最高，相關(guān)有機(jī)物代謝最為活躍。

圖4 在發(fā)酵進(jìn)程中不同墊料組合異位發(fā)酵床中細(xì)菌群落組成在門水平（a）和屬水平（b）的分類群的相對豐度Figure 4 Relative abundance of the taxonomic group at the gate level（a）and genus level（b）of the different litter combination EFSs in the fermentation process

圖5 不同墊料組合異位發(fā)酵床脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因差異Figure 5 Gene differentials related to lipid，ammonium acid and carbohydrate metabolism in different litter combinations in EFSs

2.5 異位發(fā)酵床微生物群落與環(huán)境因素間的關(guān)聯(lián)性

本試驗(yàn)通過冗余分析來分析細(xì)菌群落與環(huán)境因素之間的相關(guān)性。冗余分析（圖6）中帶有箭頭的藍(lán)色線條表示不同的環(huán)境因子，線條越長對樣本微生物群落的影響越大。藍(lán)色線條與紅色小三角形所代表的不同微生物物種成銳角表示這些物種與環(huán)境因子呈正相關(guān)，成鈍角表示負(fù)相關(guān)。如圖6所示，pH、MC和NH+4-N濃度是影響微生物群落組成的主要因素。結(jié)合圖4（b）的結(jié)果，芽孢桿菌屬和乳桿菌屬與EC值有較強(qiáng)的正相關(guān)性；鞘銨醇桿菌屬、假單胞菌屬等與pH、MC和NH+4-N濃度呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)性。另外，處在第四象限的墊料中能引起細(xì)菌感染的克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、大腸桿菌屬-志賀氏菌屬與GI值（種子發(fā)芽指數(shù)）正相關(guān)，與pH、MC和NH+4-N濃度負(fù)相關(guān)。

圖6 微生物群落與環(huán)境因素之間的關(guān)聯(lián)性分析Figure 6 Correlation analysis between microbial community and environmental factors

3 討論

異位發(fā)酵床發(fā)酵是根據(jù)微生態(tài)理論和生物發(fā)酵理論，在豬舍外利用稻殼木屑等建立一定厚度的發(fā)酵床，豬所排出的糞尿在發(fā)酵床上經(jīng)過特殊的微生物菌群發(fā)酵迅速降解消化，從而實(shí)現(xiàn)糞尿完全降解的無污染和零排放養(yǎng)殖的一種技術(shù)，是通過微生物的代謝作用將墊料和糞污中的有機(jī)質(zhì)不斷消化腐熟的過程。發(fā)酵床墊料為微生物提供碳源、氮源，保持孔隙率，對發(fā)酵進(jìn)程中溫度、水分含量、pH等理化因素都有顯著影響。溫度是評(píng)價(jià)發(fā)酵效果的關(guān)鍵指標(biāo)，能夠準(zhǔn)確反映發(fā)酵床的發(fā)酵效率和微生物群落活性[15-16]。通過與礱糠和木屑組成的傳統(tǒng)墊料組合進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)添加水稻秸稈和油菜秸稈的墊料組合前期升溫迅速，這可能是由易降解的有機(jī)化合物被發(fā)酵床微生物群落迅速降解導(dǎo)致的[17]。3組處理的嗜溫期都保持在40～55℃之間，符合前人研究中得出糞肥發(fā)酵的最佳溫度為40～65℃[18]這一結(jié)論。在整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中，Y組升溫更快，且高溫維持期久，這可能與不同的墊料組成造成發(fā)酵床的曝氣量、保水性、營養(yǎng)組成不同有關(guān)。水分含量是發(fā)酵進(jìn)程中的重要參數(shù)。含水量過高會(huì)導(dǎo)致墊料中的氣體擴(kuò)散速率下降，使得氧氣含量無法滿足微生物的代謝需求[19]。整個(gè)發(fā)酵過程中，不同墊料組合的發(fā)酵床的水分含量一直維持在40%～50%。發(fā)酵前期床體水分含量較低，通過每隔3 d添加豬糞尿補(bǔ)充水分使得墊料中水分有所上升，促進(jìn)了發(fā)酵的進(jìn)行。墊料中的pH能夠影響發(fā)酵進(jìn)程中的微生物活性[20]。3組墊料組合的pH變化趨勢相似，都是從弱酸性不斷升高為弱堿性，但添加油菜秸稈和水稻秸稈組合的pH上升速率更快。發(fā)酵前期墊料pH呈弱酸性可能是由于發(fā)酵床中含有大量的有機(jī)酸，而微生物分解速率還較低。添加油菜秸稈和水稻秸稈組合相比CK組結(jié)構(gòu)更加疏松、曝氣率更高，更高的氧氣含量使好氧微生物分解有機(jī)酸的速率更快。有研究指出5.5～8.5是發(fā)酵的最佳pH范圍[21-22]，此范圍內(nèi)更有利于微生物的代謝活動(dòng)。EC值表示發(fā)酵床的總鹽含量，發(fā)酵進(jìn)程中隨著微生物群落代謝活動(dòng)增強(qiáng)，分解有機(jī)質(zhì)并產(chǎn)生大量的鹽離子，如銨離子和磷酸鹽導(dǎo)致EC值增加[23]；而EC值的減少可能是由于發(fā)酵進(jìn)程中氨的揮發(fā)和礦物鹽的沉淀[24]。EC值過高的墊料不適于植物的生長，無法作為成熟的有機(jī)肥，Y、S組墊料EC值一直保持較低水平。發(fā)酵進(jìn)程中隨著溫度不斷升高進(jìn)入嗜溫期，此時(shí)墊料中占據(jù)主導(dǎo)作用的氨化作用將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮。高溫會(huì)抑制硝化細(xì)菌進(jìn)行硝化作用產(chǎn)生硝態(tài)氮[25]，導(dǎo)致硝態(tài)氮增加緩慢且含量不高。在整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中，Y組銨態(tài)氮含量最低，硝態(tài)氮含量最高，說明Y組能夠更多地保留氮元素，使得糞污發(fā)酵腐熟形成有機(jī)肥。在發(fā)酵床中，C作為微生物群落的能量來源，N作為組成細(xì)菌結(jié)構(gòu)必要元素，直接影響微生物生長繁殖。有研究指出調(diào)整墊料C/N為25～30∶1，能保持微生物最大生物活性，有利于發(fā)酵進(jìn)程的加快[24，26]。發(fā)酵進(jìn)程中，微生物活動(dòng)不斷增強(qiáng)使墊料中的有機(jī)質(zhì)不斷分解導(dǎo)致C/N不斷降低，這與張苗等[27]在發(fā)酵床熟化墊料肥料化發(fā)酵特性的研究中得到的結(jié)果相似。水稻秸稈墊料組合和油菜秸稈墊料組合與傳統(tǒng)的墊料組合理化指標(biāo)變化相似，油菜墊料組合更有利于形成有機(jī)肥。

墊料組成在影響發(fā)酵理化指標(biāo)的同時(shí)影響微生物群落的活性。通過分析不同墊料組合發(fā)酵進(jìn)程中微生物的OUT變化和菌群微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)添加水稻秸稈和油菜秸稈的墊料組合中微生物豐度和多樣性要高于對照組合，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各組處理微生物群落的豐富度逐漸降低，這個(gè)結(jié)果與黃雅楠等[28]研究結(jié)果相似。3組墊料組合異位發(fā)酵床的細(xì)菌群落在門和屬的分類水平上組成相似但含量變化差別明顯。在門的分類水平上，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門3個(gè)門占據(jù)著絕對的優(yōu)勢地位，這也與之前的一些研究結(jié)果相似[29-30]，養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料菌群主要是由變形菌門、厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門、芽單孢菌門（Gemmatimondetes）、綠彎菌門（Cholroflexi）等組成。在屬水平上，芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、鞘銨醇桿菌屬、假單胞菌屬等占據(jù)嗜溫期的主導(dǎo)地位。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬微生物具有耐熱性，是常見的從環(huán)境中分離得到的木質(zhì)纖維素降解微生物[31]；水稻、油菜秸稈中的木質(zhì)纖維素被纖維素降解菌群利用分解，從而釋放大量的熱量使發(fā)酵床溫度升高。乳桿菌屬微生物能夠利用墊料中木質(zhì)纖維素，并分解糞便中的氨氣、硫化氫等有毒臭味氣體，且乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸具有較強(qiáng)的殺菌能力，有顯著抑制有害微生物活動(dòng)的作用[32-33]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，墊料中能引起細(xì)菌感染的克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、大腸桿菌屬-志賀氏菌屬的相對豐度大幅減少。這與陳倩倩等[34]研究結(jié)果相似，他們通過檢測不同等級(jí)的發(fā)酵床墊料中的致病菌群發(fā)現(xiàn)隨著墊料的逐步腐熟，大腸桿菌、志賀氏菌、魏氏梭菌和副豬嗜血桿菌等致病菌含量不斷降低。這表明秸稈墊料異位發(fā)酵床發(fā)酵過程中微生物群落能快速降解豬糞尿中有機(jī)質(zhì)，并抑制有害微生物的活動(dòng)。

3組墊料組合的異位發(fā)酵床中發(fā)酵前期脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因拷貝數(shù)最高，可能與發(fā)酵前期溫度較高有關(guān)，較高溫度使嗜熱微生物相關(guān)基因代謝活動(dòng)更加活躍。Song等[35]研究了微生物對食物垃圾堆肥進(jìn)程中碳水化合物代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)碳水化合物的降解主要發(fā)生在嗜熱階段。S組與CK組的脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因豐度相似，而Y組脂類、氨基酸和碳水化合物代謝的相關(guān)基因豐度比CK更高，代謝更加活躍。Zhou等[36]研究了生物炭影響稻草堆肥進(jìn)程中微生物群落的演替和代謝功能，發(fā)現(xiàn)生物炭的添加顯著增加了與氨基酸代謝和碳水化合物代謝相關(guān)的序列的豐度，并提高了堆肥產(chǎn)品的成熟度和肥力。上述結(jié)果說明了水稻秸稈和油菜秸稈部分替換傳統(tǒng)發(fā)酵床墊料，加快了微生物的代謝，更有利于異位發(fā)酵床墊料的腐熟。異位發(fā)酵床好氧發(fā)酵過程中，涉及一系列細(xì)菌群落和環(huán)境因素的變化，環(huán)境因素是微生物群落變化的主要驅(qū)動(dòng)力[37]。此次試驗(yàn)中，pH、MC和NH+4-N濃度是影響微生物群落組成的主要因素，這與一些研究結(jié)果相似，通常溫度、pH、MC和NH+4-N濃度被認(rèn)為是影響發(fā)酵床微生物群落的主要環(huán)境指標(biāo)[38]。

4 結(jié)論

（1）油菜秸稈墊料組前期升溫速率更快、發(fā)酵高溫期相同并且最高溫度更高，說明油菜秸稈墊料組更有利于發(fā)酵床的高溫運(yùn)行。

（2）油菜秸稈墊料組能夠更多地保留氮元素，更有利于糞污發(fā)酵腐熟形成有機(jī)肥。

（3）不同墊料組合的主要微生物群落組成及演替趨勢相似，但秸稈墊料組的微生物豐富度和多樣性均高于對照組，且油菜秸稈組脂類、氨基酸和碳水化合物相關(guān)代謝更加活躍。