張宏麗，葛 雷，吳彩鳳，張樹山，張德福，戴建軍*，孫玲偉

(1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海201106)

我國地方豬種資源十分豐富，且擁有很多獨(dú)特的遺傳特性，受到國內(nèi)外育種者的高度重視。由于各種原因，有些地方豬種數(shù)量急劇下降，甚至絕種，需要應(yīng)用各種技術(shù)來保存地方豬種種質(zhì)資源。畜禽遺傳資源保存的方法有活體動(dòng)態(tài)保存和靜態(tài)保種，靜態(tài)保種包括配子、精子和胚胎的超低溫冷凍保存和DNA文庫保存。體細(xì)胞冷凍因簡單、有效和更具可操作性，且采集時(shí)不影響動(dòng)物健康，受到越來越廣泛的重視，其在優(yōu)良種畜資源保種和瀕危物種保種中具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。

梅山豬是我國一個(gè)優(yōu)良的地方品種，以繁殖力高、使用年限長和肉質(zhì)鮮美而著稱[2-3]。為保存梅山豬豬種種質(zhì)資源，本研究采用組織塊培養(yǎng)法建立了梅山豬耳成纖維細(xì)胞系，并對所建細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)特性研究，以期使這一優(yōu)良資源得到保護(hù)，也為其他動(dòng)物保種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

梅山豬耳緣組織采自上海嘉定區(qū)梅山豬育種中心。

1.2 主要試劑

無特殊說明外，所有培養(yǎng)用液體均為Gibco公司產(chǎn)品，生化試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 耳成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇

原代培養(yǎng)(G0代)：耳部邊緣剪毛清潔后，用酒精棉球多次消毒，無菌剪取3 mm×4 mm的組織塊，放入含1 000 IUmL雙抗的D-Hanks液中，4 ℃保存，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用手術(shù)刀片刮去耳緣組織外部表皮組織，D-Hanks液沖洗3次。將組織塊轉(zhuǎn)移到青霉素小瓶中，滅菌剪刀剪至糊狀后均勻地鋪在T-25培養(yǎng)瓶的底壁，翻轉(zhuǎn)后加入5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS+100 IU雙抗+1%丙酮酸鈉)，置于CO2培養(yǎng)箱中貼壁孵育。孵育6—8 h后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，使細(xì)胞培養(yǎng)液慢慢浸沒組織塊，靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每3天換1次液，換液時(shí)盡量避免組織塊懸浮。

傳代：當(dāng)細(xì)胞匯合至80%—90%時(shí)，去掉原培養(yǎng)液，D-Hanks液清洗2次，加入2 mL 37℃預(yù)熱的0.25%胰酶，消化2 min，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，離心重懸浮，按1∶2的比例分瓶，放入37℃、5% CO2和 100%濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

凍存：待培養(yǎng)的細(xì)胞匯合至80%—90%時(shí)，常規(guī)消化和離心細(xì)胞，用2 mL細(xì)胞凍存液重懸。將細(xì)胞懸液分裝到兩個(gè)2 mL的凍存管中，置于凍存盒中后在-80 ℃冰箱中過夜，置于液氮中冷凍保存。

復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存管，迅速37 ℃水浴，輕輕晃動(dòng)至細(xì)胞溶液完全融化。離心重懸浮后移入T-25培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 冷凍前后細(xì)胞存活率

冷凍前后的細(xì)胞用0.4%的臺盼藍(lán)染液進(jìn)行染色，稀釋后滴到血球計(jì)數(shù)板，加蓋玻片，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。顯微鏡下活細(xì)胞不能被著色，而死細(xì)胞被染成藍(lán)色。

1.5 生長曲線

G2代耳成纖維細(xì)胞經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，使其終濃度為1×104個(gè)mL，接種到24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。使用血球計(jì)數(shù)板從第2天開始計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)8 d，每天計(jì)數(shù)3個(gè)孔，取平均值。細(xì)胞培養(yǎng)過程中每3 d換液1次。計(jì)數(shù)結(jié)果制成的折線圖即為細(xì)胞的生長曲線。

1.6 微生物檢測

檢測細(xì)菌、真菌時(shí)，將細(xì)胞等量接種于胰蛋白胨和麥芽汁培養(yǎng)基中，并設(shè)陰性和陽性對照[4-5]。

從裝飾花紋上看，無論是工筆還是寫意其表現(xiàn)出的題材都具有吉祥道喜之意。在這些紋樣中一般表現(xiàn)的題材有花卉紋、山石、海水紋、魚藻紋、回紋、卷線紋、龍、鳳、麒麟紋、松、竹、梅紋、人物紋等。這些紋路一一反應(yīng)出當(dāng)時(shí)的社會文化。

支原體污染檢測使用支原體染色試劑盒(碧云天)。檢測之前，細(xì)胞用不含雙抗的培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2—3次。

1.7 染色體分析

選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制備染色體標(biāo)本，按照常規(guī)試驗(yàn)方法制備染色體[6]。待染色體標(biāo)本在空氣中完全干燥后，用Giemsa溶液室溫下染8 min左右，流水沖洗掉多余的染液，室溫下干燥。片子干燥后，在顯微鏡下觀察，并統(tǒng)計(jì)拍照。

1.8 同工酶酶譜分析

取生長旺盛的細(xì)胞，常規(guī)消化和收集細(xì)胞，PBS洗3次后加細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，分裝置于-80℃冰箱保存。制備7.5%分離膠和3%濃縮膠以及電泳緩沖液，加樣，電泳條件為160 V、3 h。電泳結(jié)束后，把分離膠放到染色槽里進(jìn)行乳酸脫氫同工酶和蘋果酸脫氫同工酶染色，37 ℃水浴鍋中染色40 min。染色結(jié)束后，回收染色液，加入脫色液進(jìn)行脫色，過夜，拍照[7]。

1.9 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染和單克隆培養(yǎng)

采用Lipofectamine LTX and PLUSTM試劑盒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒采用含NEO抗性基因的EGFP質(zhì)粒，主要步驟如下：取100 μL OPTI-MEM，分別加入1 μg質(zhì)粒DNA，1 μL PLUS，混勻后靜置5 min，加入2.5 μL LTX，混勻后室溫放置30 min。將獲得的轉(zhuǎn)染液輕輕加入含400 μL 的OPTI-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕漩渦混勻，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液，24 h后觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。單克隆篩選時(shí)，先使用400 μgmL的G418連續(xù)培養(yǎng)7 d，再使用200 μgmL G418進(jìn)行維持，直到單克隆出現(xiàn)為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅山豬成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)5—14 d的培養(yǎng)，可見耳緣組織塊周圍有細(xì)胞爬出，細(xì)胞呈典型的成纖維形、長梭形、三角形等。成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間及對胰蛋白酶敏感程度不同，原代細(xì)胞中有少量的上皮細(xì)胞用胰蛋白酶消化的方法進(jìn)行傳代，使成纖維細(xì)胞純化，傳代后的細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀生長(圖1)。

2.2 梅山豬成纖維細(xì)胞冷凍前后細(xì)胞存活率

隨機(jī)選取5個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，培養(yǎng)的梅山豬耳成纖維細(xì)胞冷凍前后的平均細(xì)胞存活率分別為95.21%、90.08%。圖2為細(xì)胞冷凍前后臺盼藍(lán)染色圖片，死亡細(xì)胞染色后呈藍(lán)色。

2.3 梅山豬成纖維細(xì)胞生長的動(dòng)態(tài)觀察

2.4 微生物檢測

細(xì)菌和真菌檢測后，接種細(xì)胞的液體培養(yǎng)基未出現(xiàn)混濁及其他變化，培養(yǎng)基清亮透明，表明未有細(xì)菌和真菌污染，陽性對照的培養(yǎng)基中則出現(xiàn)明顯的混濁或沉淀。

支原體試劑盒檢測后，所有成纖維細(xì)胞表面光滑，細(xì)胞核呈橢圓形，發(fā)出藍(lán)色熒光，未觀察到細(xì)胞周圍微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光，顯示細(xì)胞均無支原體污染(圖4)。

2.5 梅山豬耳成纖維細(xì)胞染色體觀察

隨機(jī)挑選5個(gè)處于對數(shù)增長期的梅山豬耳成纖維細(xì)胞系進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)(圖5)，染色體數(shù)目為38條的比例為92.31%，說明所建立的細(xì)胞系是穩(wěn)定的二倍體，符合建系要求。

2.6 同工酶分析

如圖6所示，乳酸脫氫同工酶酶譜中有 5 條帶，從陰極到陽極依次為 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和 LDH5，相對遷移率分別為1.85%、5.56%、16.67%、25.00%和 32.40%；蘋果酸脫氫同工酶酶譜中有2條區(qū)帶，依次為m-MDH 和s-MDH，相對遷移率分別為28.15%和36.11%。

2.7 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，5個(gè)細(xì)胞系均能產(chǎn)生綠色熒光，EGFP陽性率為45.23%—67.32%。經(jīng)G418篩選后，各個(gè)細(xì)胞系均能有效形成單克隆集落。部分結(jié)果如圖7所示。

3 結(jié)論與討論

常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法，陸會寧等[8]比較了不同的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，結(jié)果表明組織塊貼壁法效果最好。周向梅等[6]采用貼壁培養(yǎng)原代細(xì)胞，1—2 d可見組織塊周圍有細(xì)胞爬出，郝柱等[9]研究表明細(xì)胞是在2—3 d長滿培養(yǎng)瓶，而本研究中最早5 d可見組織塊周圍有細(xì)胞生長，可能是因?yàn)榻M織來源不同所致。另外，本研究中傳代細(xì)胞生長速度比原代細(xì)胞快，第2天即進(jìn)入指數(shù)對數(shù)生長期，得到的成纖維細(xì)胞冷凍前后均有較高的存活率，表明液氮冷凍保存對細(xì)胞損傷較小[10-11]。

細(xì)胞建系時(shí)染色體分析尤為關(guān)鍵，本研究中92.31%的豬耳成纖維細(xì)胞染色體數(shù)目為38條，與正常豬的染色體數(shù)目相同[12-13]，符合細(xì)胞建系要求。

不同的動(dòng)物品種，同工酶是存在差異的[14-15]。常用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對同工酶進(jìn)行分析，檢測細(xì)胞是否存在種間污染[16]。大多數(shù)哺乳動(dòng)物乳酸脫氫同工酶酶譜(Lactate dehydrogenase，LDH)有5條區(qū)帶，分別是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和 LDH5，蘋果酸脫氫同工酶酶譜(Malate dehydrogenase，MDH)有m-MDH 和s-MDH 2條區(qū)帶，前者遷移率比后者小。本研究中梅山豬耳成纖維細(xì)胞系LDH五條帶的相對遷移率分別為1.85%、5.56%、16.67%、25.00%和 32.40%，m-MDH和s-MDH的相對遷移率分別為28.15%和36.11%，與郝柱等[9]在金華豬耳成纖維細(xì)胞上的LDH 酶譜(遷移率15.23%、29.55%、44.84%、58.45%和93.40%)和MDH 酶譜(遷移率48.39%和67.74%)，以及關(guān)偉軍[17]等在五指山小型豬耳纖維細(xì)胞上的LDH酶譜(遷移率18.75%、28.75%、41.25%、51.25%和 60.00%)及MDH 酶譜(遷移率48.39%和67.74%)有較大差異，表明本研究所培養(yǎng)的梅山豬耳成纖維細(xì)胞純度更高。

本研究中細(xì)胞經(jīng)EGFP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，大部分細(xì)胞發(fā)出熒光，表明所建立的細(xì)胞系適合于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。此外，本研究所抽取的5個(gè)細(xì)胞系經(jīng)G418篩選后均能有效形成單克隆集落，表明細(xì)胞生長旺盛，對篩選藥物較為敏感，這些細(xì)胞系可為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因克隆等研究提供素材[18-19]。

梅山豬是國內(nèi)地方豬種的優(yōu)良品種，為保護(hù)該品種種質(zhì)資源，本研究從細(xì)胞水平對梅山豬耳纖維細(xì)胞進(jìn)行建系，所建細(xì)胞系生長快、生物穩(wěn)定性好，為以后對梅山豬的深入研究提供生物材料，并可為其他動(dòng)物建系提供參考依據(jù)。