陳 曉，戴建軍，李 垚，吳彩鳳，張樹山，孫玲偉，張德福，李 麗

(1上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106；3錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，錦州 121001；4上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海200025)

崇明白山羊被喻為“長江三角洲白山羊”，是崇明地方特有的優(yōu)良品種。崇明白山羊體型中等偏小，白色被毛，體格健壯，具有適應(yīng)力強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、產(chǎn)肉性能高、繁殖性能高等優(yōu)質(zhì)品性[1]。目前崇明白山羊飼養(yǎng)總量達(dá)到50萬頭左右，上海市崇明地區(qū)已對(duì)崇明白山羊農(nóng)產(chǎn)品實(shí)施地理標(biāo)志性保護(hù)。作為全國重點(diǎn)保護(hù)和發(fā)展的家畜品種，其在形態(tài)學(xué)、生理生化方面研究較多，但基于分子水平的研究尚少。研究崇明白山羊群體的遺傳多樣性對(duì)于該品種資源的科學(xué)有效保護(hù)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化應(yīng)用具有實(shí)際意義。

ISSR即簡(jiǎn)單重復(fù)序列間分子標(biāo)記，是基于SSR基礎(chǔ)之上迅速發(fā)展起來的，并廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物居群遺傳學(xué)研究的一項(xiàng)新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)[2]。其原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA作為引物，并在SSR序列的3’或者5’端加入2—4個(gè)隨機(jī)核苷酸，對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、試驗(yàn)成本低、信息量大、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。本研究旨在采用ISSR技術(shù)對(duì)崇明白山羊的遺傳多樣性與親緣關(guān)系進(jìn)行分析，并掌握崇明白山羊遺傳多樣性的現(xiàn)狀，以期對(duì)其種質(zhì)資源的合理保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自上海市崇明地區(qū)崇明白山羊群體，由90只公羊和116只母羊組成，共計(jì)206只。每只山羊頸靜脈采血約6 mL，存放在抗凝采血管中置于-20℃?zhèn)溆?。采用全血基因組DNA提取試劑盒提取崇明白山羊的血液基因組DNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品的質(zhì)量和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物篩選

根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第九套100條ISSR引物序列中篩選出12條引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 ISSR引物序列

注：Y=(C,T)，R=(A,G)

1.3 PCR反應(yīng)與條帶記錄

PCR總反應(yīng)體系為25 μL，含模板DNA 10—20 ngμL，引物10 μmolL，氯化鎂3 mmolL，dNTP 500 μmolL，0.1U Taq DNA聚合酶。其反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 60 s，49—63℃ 60 s，72℃ 90 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)(1×TAE,120 V,1 h)，以Marker DL 2000作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。在電泳圖譜中記錄清晰可見的條帶，每一條帶記為一個(gè)位點(diǎn)，在指定遷移位置有條帶出現(xiàn)時(shí)，被認(rèn)為是相同的DNA片段產(chǎn)物，存在擴(kuò)增條帶則記為“1”，缺失條帶則記為“0”，建立譜帶“01”矩陣二元數(shù)據(jù)。

1.4 參數(shù)統(tǒng)計(jì)與處理

應(yīng)用NTSYS和POPGEN軟件來檢測(cè)遺傳多樣性指標(biāo)，分析親緣關(guān)系。各群體內(nèi)遺傳參數(shù)包括：ISSR-PCR產(chǎn)物的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(h)、Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、遺傳分化值(Gst)及基因流(Nm)。

為評(píng)估崇明白山羊群體遺傳關(guān)系，根據(jù)POPGENE計(jì)算得出遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，使用NTSYS.pc 2.10e軟件按照非加權(quán)組平均法(UPGMA)對(duì)崇明白山羊個(gè)體間構(gòu)建聚類分析圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 崇明白山羊ISSR擴(kuò)增結(jié)果

12條引物在206個(gè)樣本中共產(chǎn)生181條符合數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出15.08條，其中多態(tài)性條帶163條，占總條帶數(shù)的90.06%，部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1。

2.2 崇明白山羊遺傳多樣性

將ISSR擴(kuò)增的結(jié)果轉(zhuǎn)化成0，1二元矩陣后，輸入POPGENE統(tǒng)計(jì)軟件，檢測(cè)到90只崇明白山羊公羊個(gè)體、116只崇明白山羊母羊個(gè)體，共206只崇明白山羊的各項(xiàng)指標(biāo)(表2)。結(jié)果顯示，崇明白山羊群體具有較高的遺傳多樣性，其中公羊的各項(xiàng)遺傳多樣性水平均高于母羊。

表2 崇明白山羊群體的遺傳多樣性

組別群體總基因多樣性(Ht)群體內(nèi)基因多樣性(Hs)遺傳分化值(Gst)基因流(Nm)崇明白山羊0.279 7±0.034 00.226 7±0.025 80.189 42.139 7

2.3 崇明白山羊的聚類分析

將ISSR擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)化成0，1二元矩陣后，輸入NTSYS.pc2.10e軟件中，得到206只崇明白山羊樣本的相似性系數(shù)為0.519 3—0.989 0，遺傳距離為0.147 4—0.863 0，其中204號(hào)、205號(hào)個(gè)體的遺傳相似系數(shù)最高，達(dá)到了0.989 0，說明這兩個(gè)個(gè)體的遺傳相似度較高，即兩者的親緣性較近。使用UPGMA方法對(duì)崇明白山羊個(gè)體間進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖譜(圖2)，在遺傳相似系數(shù)0.83處，可將206個(gè)群體劃分11類，第一類包括10個(gè)個(gè)體(1—10號(hào))，第二類包括1個(gè)個(gè)體(11號(hào))，第三類包括50個(gè)個(gè)體(12—50號(hào)，52—62號(hào))，第四類包括1個(gè)個(gè)體(51號(hào))，第五類包括28個(gè)個(gè)體(63—90號(hào))，第六類包括29個(gè)個(gè)體(91—96號(hào)，98—120號(hào))，第七類包括13個(gè)個(gè)體(170—182號(hào))，第八類包括22個(gè)個(gè)體(121—142號(hào))，第九類包括27個(gè)個(gè)體(143—169號(hào))，第十類包括24個(gè)個(gè)體(183—206號(hào))，第十一類包括1個(gè)個(gè)體(97號(hào))，且前五類均為公羊個(gè)體，后六類均為母羊個(gè)體。

3 討論

物種遺傳多樣性的存在能夠維持物種的生存和進(jìn)化能力[5]，物種在歷經(jīng)漫長的時(shí)間選擇和基因突變后，遺傳多樣性也會(huì)隨之提高，物種遺傳多樣性既是評(píng)價(jià)生物進(jìn)化水平的重要指標(biāo)，也是維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ)[6]，多數(shù)物種的滅絕都是因?yàn)檫z傳多樣性水平的降低所造成，所以保護(hù)物種的種質(zhì)資源意義重大。近年來ISSR技術(shù)在遺傳多樣性及親緣性問題的研究中已廣泛得到應(yīng)用[7-9]，此項(xiàng)技術(shù)作為物種基因組多態(tài)性的分析，避免了環(huán)境與地理位置的限定，其多態(tài)性較高，獲得的信息量多于PAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)分子標(biāo)記技術(shù)，精確程度可與RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)相比較[10-11]。本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)崇明白山羊大量樣本進(jìn)行遺傳分析探討，以期更為準(zhǔn)確的揭示崇明白山羊遺傳多樣性及親緣關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示：公羊的各項(xiàng)遺傳多樣性水平要高于母羊，崇明白山羊整體遺傳多樣性豐富，其中PPB、Na、Ne、h、I值均高于鄭佩培等[12]使用ISSR技術(shù)對(duì)崇明白山羊的分析。遺傳分化值通常被用以衡量群體間的遺傳分化程度，參照Buso等[13]的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Gst為0.05—0.15定義為中等分化程度，本研究中崇明白山羊的Gst為0.189 4，說明其遺傳分化程度較低，崇明白山羊的遺傳變異有81.06%發(fā)生在種群內(nèi)，而種群間的遺傳變異僅有18.94%?；蛄髯鳛橛绊戇z傳結(jié)構(gòu)的重要因素，與種群大小并無關(guān)系，當(dāng)NM值≥1時(shí)便可以防止因遺傳漂變引起的種群遺傳分化[14]，本研究中崇明白山羊的NM為2.139 7，說明崇明白山羊群體間存在一定的基因流，但遺傳漂變并不是影響崇明白山羊種群間分化的主要因素，遺傳分化的主要原因是由于種群內(nèi)部的遺傳變異，崇明白山羊群體具有一定的適應(yīng)能力。崇明白山羊雖然在地理分布條件上較為局限，但其遺傳多樣性水平依然穩(wěn)定，但崇明白山羊的 Ne低于Na，表明在群體內(nèi)存在較多低頻率的等位基因，因此應(yīng)對(duì)現(xiàn)有低頻率基因?qū)嵤┯行ПＷo(hù)，從而避免基因丟失現(xiàn)象的發(fā)生。

利用NTSYS.pc2.10e軟件，得出崇明白山羊的相似性系數(shù)為0.519 3—0.989 0，高于西藏日土藏山羊遺傳相似系數(shù)，后者為0.460 0—0.740 5[19]。崇明白山羊的遺傳距離為0.147 4—0.863 0，根據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)崇明白山羊的個(gè)體聚類分析后，這206個(gè)個(gè)體可劃分為11個(gè)群體，其中公羊的群體樣本基本聚集一起，母羊的群體樣本也基本聚集在一起，第一類與第二類為大種公羊聚為一支，第三類與第四類為成年公羊聚為一支，第五類為小公羊與成年公羊聚為一支，第六類與第七類為成年母羊聚為一支，第八類與第九類為成年母羊聚為一支，第十類為小母羊與成年母羊聚為一支，第十一類成年母羊與小母羊優(yōu)先聚為一支。可以發(fā)現(xiàn)97號(hào)個(gè)體與其他成年母羊群體的個(gè)體間遺傳距離較遠(yuǎn)，說明97號(hào)個(gè)體與其他母羊的群體個(gè)體可能源自不同的類群。

種群達(dá)到瓶頸期是物種遺傳多樣性水平降低的重要因素，一旦種群的數(shù)量減少就會(huì)導(dǎo)致遺傳多樣性的降低，那么物種就會(huì)存在瀕臨滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。本研究主要應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)崇明白山羊進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳聚類的分析，初步得出了該物種的遺傳多樣性信息，研究結(jié)果有利于制定和實(shí)施有效保護(hù)崇明白山羊的遺傳資源方案。