馬玉飛，李本強(qiáng)，陶 潔，程靖華，劉 雷，劉惠莉*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201106；2 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

豬Delta冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ-冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)，是一種新發(fā)現(xiàn)的單股正鏈RNA病毒，主要感染小腸，尤其是空腸末端和回腸，可引起嚴(yán)重的腸炎并伴有腹瀉、脫水等癥狀，臨床特征與豬流行性腹瀉(PED)和豬傳染性胃腸炎(TGE)相似，但該病毒可致哺乳期仔豬產(chǎn)生較高死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Ma等[1]將分離到的PDCoV病毒接種新生仔豬，所有接種豬只均發(fā)生水樣腹瀉、嘔吐等流行性腹瀉樣癥狀。

PDCoV基因組全長(zhǎng)大約25 kb，是所有冠狀病毒中基因組最小的，其基因組成、排列與其他冠狀病毒相似，包括5’和3’非翻譯區(qū)以及7個(gè)開放閱讀框，編碼4 種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：纖突(S)蛋白、囊膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白。研究表明，PDCoV 的M基因在不同毒株之間的同源性大于90%，與其他冠狀病毒M基因的同源性均小于50%[2]。PDCoV作為豬病毒性腹瀉的新病原，逐漸受到了關(guān)注，繼美國(guó)成功分離到2株P(guān)DCoV之后[3]，陳建飛等[4]成功分離到了國(guó)內(nèi)首株P(guān)DCoV。但因很多腹瀉類病毒都主要感染小腸部位，運(yùn)用傳統(tǒng)方法中的臨床剖檢和顯微鏡觀察很難將PDCoV與其他豬腹瀉病毒加以區(qū)分。本研究以PDCoV保守的M基因?yàn)閿U(kuò)增目的片段，建立RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)臨床PDCoV感染情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，為了解PDCoV在豬腹瀉疫病中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與病毒

2015—2017年從上海及周邊豬場(chǎng)采集518份有腹瀉癥狀豬的糞便樣品。

豬流感病毒(SIV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬輪狀病毒(PoRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及大腸桿菌(E.coli)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

M-MLV RNA聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、500 bp DNA Maker、pMD-18T載體等PCR試劑均購(gòu)自TaKaRa公司(日本)；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已發(fā)表PDCoV 毒株的M基因序列，應(yīng)用DNASTAR和Oligo 7軟件針對(duì)M基因保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，此外，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6]，設(shè)計(jì)并合成豬嵴病毒(PKV)、豬星狀病毒(PAstV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)的檢測(cè)引物(表1)。引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 臨床樣品的處理與總RNA的提取

將糞便樣品用PBS按照1∶5比例稀釋，震蕩混勻，靜置10 min，取250 μL上清液與750 μL Trizol裂解液，震蕩混合，冰浴靜置10 min；加入200 μL三氯甲烷，震蕩混勻，冰浴靜置5 min，4 ℃ 12 000 rmin離心15 min；吸取上清，加入等體積的異丙醇，-20 ℃沉淀15 min；4℃ 12 000 rmin離心15 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌；4℃ 12 000 rmin離心15 min，棄上清并吹干；用20 μL無(wú)RNase DEPC水溶解RNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反轉(zhuǎn)錄

取10 μL RNA，2 μL primer mix，1 μL M-MLV，1 μL RNase inhibitor，4 μL 5×RT M-MLV Buffer，2 μL dNTP，混勻。反應(yīng)程序：42 ℃ 1 h；75 ℃ 15 min；4 ℃ 1 h。制備的cDNA模板-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

取2 μL cDNA，2.5 μL 10×PCR Buffer，1.5 μL dNTP，0.5 μL Taq酶，上、下引物各0.4 μL，超純水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；X ℃，30 s；72 ℃，30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃保存。設(shè)置7個(gè)退火溫度(X)，分別是：49 ℃、51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD-18T載體，16 ℃作用30 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板。挑取平板上單個(gè)菌落進(jìn)行搖菌，菌液PCR進(jìn)行鑒定，將疑似陽(yáng)性菌液送公司測(cè)序，待序列正確后，將相對(duì)應(yīng)的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 RT-PCR方法的特異性檢測(cè)

以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大腸桿菌(E.coli)反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，利用優(yōu)化后的擴(kuò)增體系進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的特異性。

1.9 RT-PCR方法的敏感性測(cè)定

利用 pMD-18T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，測(cè)定其濃度并計(jì)算拷貝數(shù)。進(jìn)一步將構(gòu)建的重組質(zhì)粒按照10-1、10-2、10-3……10-10，進(jìn)行10倍倍比稀釋，以不同稀釋度的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，測(cè)定該方法的敏感性。

1.10 臨床樣品的檢測(cè)

利用建立的RT-PCR方法對(duì)2015—2017年從上海周邊豬場(chǎng)采集的518份豬腹瀉糞便樣品進(jìn)行PDCoV病原檢測(cè)。同時(shí)，利用其他相關(guān)豬腹瀉病毒引物(PKV、PAstV、PEDV、TEGV)對(duì)PDCoV陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，以了解PDCoV病原與其他豬腹瀉病毒的混合感染情況。

1.11 M基因的遺傳進(jìn)化分析

運(yùn)用DNAstar軟件將測(cè)序獲得的10份陽(yáng)性毒株的核酸序列與GenBank中公布的PDCoVM基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)方法的建立

以腹瀉糞便樣品提取的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得與目的片段大小一致的條帶，約為281 bp(圖1)，且無(wú)非特異性擴(kuò)增，測(cè)序表明所擴(kuò)增的產(chǎn)物為PDCoV基因片段。

2.2 RT-PCR最佳退火溫度的確定

RT-PCR結(jié)果顯示，Tm在49—61℃時(shí)能夠特異性的擴(kuò)增出目的條帶，當(dāng)Tm為53 ℃時(shí)所得到的條帶相對(duì)較亮，故53 ℃為最佳退火溫度(圖2)。

2.3 RT-PCR靈敏度的確定

將制備的陽(yáng)性質(zhì)粒(3.92 x1010copiesμL)10倍倍比稀釋后，分別進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，如圖3所示，RT-PCR檢測(cè)PDCoV靈敏度的最低拷貝數(shù)為3.92 x103copiesμL。

2.4 RT-PCR特異性分析

如圖4所示，相同條件下，以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大腸桿菌(E.coli)和H2O為模板，未能擴(kuò)增出條帶，而以PDCoV為模版能擴(kuò)增出特異性目的條帶，說明建立的方法特異性強(qiáng)，與其他病原無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

利用本研究建立的RT-PCR方法對(duì)518份豬腹瀉樣品進(jìn)行PDCoV檢測(cè)，結(jié)果顯示25份樣品為陽(yáng)性，測(cè)序證實(shí)均為PDCoV，該方法陽(yáng)性檢出率為4.8%。在所檢出的陽(yáng)性樣本中，PKV和PAstV與PDCoV的混合感染率分別為40%和48%；PDCoV與PEDV混合感染率為8.0%，未檢測(cè)到PDCoV與TEGV混合感染的樣本。

2.6 PDCoV M基因的遺傳進(jìn)化分析

利用Mega6.0軟件對(duì)10株上海地區(qū)流行毒株P(guān)DCoV的M基因進(jìn)行基因序列的遺傳進(jìn)化分析和同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)流行毒株的M基因間的同源性為95%—99.6%(圖5)。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，它們與國(guó)內(nèi)PDCoVM基因參考序列的同源性為96.8%—100%，其中FM-1與四川株(S27-2012)和湖北株(CHN-JS-2014)的核酸同源性為100%。

通過分析PDCoVM基因進(jìn)化樹得知，臨床檢測(cè)到的10株上海地區(qū)流行毒株(FM-1、FM-2、JD-1、JD-2、JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5、JS-6)的M基因序列與從GenBank中所選取得到PDCoVM基因(表2)參考序列屬于同一分支。這些序列與國(guó)內(nèi)報(bào)道的豬Delta冠狀病毒的親緣關(guān)系較近，而與國(guó)外的豬Delta冠狀病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。

表2 M基因進(jìn)化樹參考毒株

3 結(jié)論與討論

PDCoV于2012年首次在香港的豬群中檢測(cè)到，相繼在美國(guó)、韓國(guó)流行[7]。2015年，董楠等[8]對(duì)湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等地規(guī)?；i場(chǎng)的215 份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到14份PDCoV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為6.5%；彭艷伶等[9]對(duì)四川省涼山地區(qū)豬腹瀉樣本中的PEDV、PDCoV和GARV進(jìn)行檢測(cè)，PDCoV檢出率高達(dá)33.33%；劉玲玲等[10]利用PDCoV和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)河南各地市的252份樣品進(jìn)行檢測(cè)，PDCoV陽(yáng)性率12.30%。本研究利用RT-PCR方法對(duì)2015—2017年上海周邊豬場(chǎng)的518份豬腹瀉樣品進(jìn)行PDCoV病原檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出25份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為4.8%，表明PDCoV在腹瀉豬群中存在一定比例。PDCoV、PEDV 和TGEV 均屬于冠狀病毒，易發(fā)生混合感染，且它們感染所引起的臨床癥狀非常相似。 Jung 等[11]對(duì)美國(guó)俄亥俄州59 份豬腹瀉病料檢測(cè)顯示，PDCoV陽(yáng)性率為29%，PEDV和PDCoV 的混合感染率為42.86%。本研究中，PEDV 和PDCoV 的混合感染率為8.0%，未檢測(cè)到PDCoV與TEGV混合感染的樣本；值得注意的是PKV和PAstV與PDCoV的混合感染率分別為40%和48%，表明PKV和PAstV對(duì)于PDCoV的致病力可能起協(xié)同或是加重作用。

相比于其他豬冠狀病毒，PDCoV的檢測(cè)和診斷方法仍處在發(fā)展中階段[12]。目前，對(duì)于PDCoV病原的檢測(cè)方法主要包括病原學(xué)檢測(cè)和抗體檢測(cè)。RT-PCR技術(shù)憑借其便捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特性已成為基因研究和分析的最常用方法之一。病原學(xué)檢測(cè)正是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)建立的檢測(cè)方法，Zhang等[13]利用豬Delta冠狀病毒的M基因建立了此病毒的多重RT-PCR和TaqMan qRT-PCR檢測(cè)方法。逢鳳嬌等[14]建立了PDCoV的RT-PCR檢測(cè)方法，PDCoV最低檢測(cè)限為6.33×104copiesμL。鄭蘭蘭等[15]利用熒光定量PCR技術(shù)建立了豬δ冠狀病毒的檢測(cè)方法。在抗體檢測(cè)方面，Thachil等[16]以S1蛋白和N蛋白作為包被抗原，建立了PDCoV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，并運(yùn)用此方法對(duì)355份血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)。

本研究建立的RT-PCR方法，具有較好的靈敏性和較強(qiáng)的特異性，最低檢測(cè)限量可達(dá)3.92×103copiesμL，其靈敏度高于逢鳳嬌等[14]建立的方法。對(duì)擴(kuò)增的M基因同源性分析表明，10株上海地區(qū)流行毒株的M基因間的同源性達(dá)95.0%—99.6%，與GenBank登錄的其他PDCoVM基因序列同源性為96.1%—100%，說明本研究檢測(cè)到的PDCoV流行株之間遺傳差異較小，但仍需持續(xù)監(jiān)測(cè)。