宋宇康 ，邢志偉 ，周國平 ，張平 ，張李陽

（南京曉莊學(xué)院，江蘇 南京 211171；2.南京龍鯽水產(chǎn)開發(fā)有限公司，江蘇 南京 211500；3.南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇 南京 210036）

龍池鯽魚因產(chǎn)于江蘇省南京市六合區(qū)城南龍池而得名，其味道鮮美，出肉率高，深受當(dāng)?shù)厥忻袂嗖A。近年來，龍池鯽魚混雜嚴重，加之過度捕撈，尋常百姓已難覓其蹤跡。該試驗通過流式細胞術(shù)（Flow Cytometry,FCM）來測定龍池中鯽魚的DNA含量來分析其倍性特征，使原有龍池中混雜的龍池鯽魚純化出來，并開展龍池鯽魚親本培育、苗種繁育以及成魚養(yǎng)殖，使龍池鯽魚實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化推廣并且加強其資源增殖，也為以后對龍池鯽魚的研究提供參考。

流式細胞術(shù)（FCM）是利用熒光染料、激光技術(shù)、單抗技術(shù)和計算機技術(shù)定量測定細胞DNA含量、細胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性等許多重要參數(shù)，是一種準確鑒定魚類倍性的理想方法。同時，該試驗采取的T型標技術(shù)為體內(nèi)標記法，為最早使用的方法之一，此法簡便又快，適用于各種魚類。加之對側(cè)線鱗數(shù)量的辨別也可作為區(qū)分二倍及三倍體魚的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗用魚于2017年11月—2018年1月，從六合龍池閘段采捕1 000尾鯽魚，暫養(yǎng)于南京龍鯽水產(chǎn)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)池為50 m×300 m，水深1.5 m。試驗前拉網(wǎng)放置于2 m×2 m×2 m的網(wǎng)箱內(nèi)待測。雞紅細胞為國際上的公認標準，其DNA含量按2.50 pg/N來計算。

1.2 T型標標記法

T型標記標記是用物理的方法，將帶有數(shù)字、文字、字母等信息的標簽注入到動物體表，肉眼可辨，方便識別，能在短時間內(nèi)標記大量的個體動物，廣泛應(yīng)用于魚類、甲殼類和貝類物種。該試驗首先將其側(cè)線鱗進行計數(shù)。在標記時，先用75%酒精將槍頭消毒后再使用。標記時應(yīng)選擇被標記魚背鰭基部下方背部肌肉最厚的部位，所使用的槍頭不能穿透魚體，用手指輕按壓被標記的部位迅速抽出標記槍，標記結(jié)束后務(wù)必對所標記部位用酒精消毒，為避免傷口感染以及疾病的傳播。

1.3 樣品的制備

完成掛牌標志后，將1 mL一次性注射器先用75%的酒精將針頭消毒，從龍池鯽魚的尾靜脈取血0.3～0.5 mL，注射在5 mL的紫色抗凝管中防止魚血凝固，然后再注入4 mL離心管中在1 000 r/min離心3 min，去除上清液。將處理好的魚血放在4℃冰盒保存送至實驗室待測。雞血取自于翅膀靜脈，處理方法同上。

1.4 樣品染色

該試驗測定DNA所用的試劑為瑞景特生物有限公司的PI試劑盒，該試劑分為A液和B液兩種對DNA進行染色測定。首先將固定的紅細胞混勻，在4℃、1 200 r/min下用預(yù)冷的PBS洗細胞2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，于4℃固定30 min，再用300 g離心5分鐘收集細胞，去除上清液，再重懸于400μL PBS中。最后制備PI綜合液，取500μL A液和2μL B液混合均勻，在每份細胞懸液中加入100μL PI綜合液，避光孵育30分鐘。然后再用300目尼龍網(wǎng)過濾后，上機檢測。

1.5 DNA含量測定

采用美國貝克曼庫爾特的FC500流式細胞儀，激發(fā)光源為20 mW氬離子激光器，激發(fā)波長488 nm，分別進行單參數(shù)檢測。使用機器前需要用標準微球調(diào)整儀器，要求CV＜5%，檢測前先做貝克曼公司質(zhì)控，質(zhì)控不合格則不可以檢測。以雞血細胞作為標準，每個樣品采集的細胞總數(shù)為104個。使用CXP軟件收集數(shù)據(jù)（每秒收集100～300個細胞），Modfit2.0軟件進行DNA細胞周期及倍性分析。

1.6 數(shù)據(jù)和圖形分析

測量的數(shù)據(jù)和圖均為計算機軟件分析所得，然后將對照樣品和待測樣品的處理資料按照統(tǒng)計學(xué)進行計算機分析。

樣品魚的DNA絕對含量按下列公式計算：

式中：P1為檢測魚紅細胞的DNA絕對含量（pg/N），P2為標準雞紅細胞DNA絕對含量（2.5 pg/N）；E1為雞紅細胞的相對DNA含量，E2為檢測魚紅細胞的相對DNA含量。

2 結(jié)果

2.1 龍池鯽魚紅細胞DNA檢測直方圖

該試驗采用雞血紅細胞做為參考標準，用流式細胞儀測定了1 000尾龍池鯽魚紅細胞的相對DNA含量。圖1為雞血紅細胞，圖2為雌性龍池鯽二倍體的流式細胞儀檢測直方圖的代表性結(jié)果，圖3為雄性龍池鯽二倍體的流式細胞儀檢測直方圖的代表性結(jié)果。

圖1 雞血的流式細胞儀檢測直方圖

直方圖中縱坐標表示檢測的細胞核數(shù)，橫坐標表示樣品細胞的平均熒光強度值，即樣品細胞的DNA相對含量。圖1中主要出現(xiàn)一個峰為G0/G1期峰，其圖像清洗干凈，前后無雜峰出現(xiàn)，說明其DNA的相對含量最低，細胞頻率最高，是細胞周期中的G0/G1期細胞；其峰形尖銳，CV＜5%，說明對樣品處理和檢測方法較好，其峰值代表DNA含量相同的G0/G1期細胞。從圖1可以看出雞紅細胞的相對DNA含量接近190，從圖2和3中可以看出二倍體龍池鯽魚的DNA相對含量接近290。實驗檢測的1 000尾龍池鯽魚中，120尾龍池鯽樣品的紅細胞核相對DNA含量接近290，占12%；880尾鯽魚接近330（為三倍體魚），占群體總數(shù)88%。

圖2 龍池鯽二倍體的流式細胞儀檢測直方圖（雌魚）

2.2 龍池鯽魚DNA含量與倍性

圖3 龍池鯽二倍體的流式細胞儀檢測直方圖（雄魚）

測定的龍池鯽魚的相對DNA含量和雞血的相對DNA含量結(jié)果見表1。從表1中可知，在所測的1 000尾龍池鯽魚群體當(dāng)中有120尾的DNA含量為3.82 pg/N，有880尾（為三倍體魚）的DNA含量為4.34 pg/N?？梢钥闯觯撛囼炈杉聂~群是由二倍體龍池鯽魚和三倍體龍池鯽魚組成的。

2.3 龍池鯽的形態(tài)學(xué)特征

該研究隨機抽取了龍池鯽魚和三倍體鯽魚共1 000條對其側(cè)線鱗進行測數(shù)，并對其體質(zhì)量、體厚、體長及體高用卷尺進行測量，將二倍體龍池鯽魚和三倍體龍池鯽魚進行比較分析。由表2可以看出，二倍體龍池鯽魚的側(cè)線鱗數(shù)量平均為28，三倍體鯽魚的側(cè)線鱗數(shù)量平均為30，二倍體龍池鯽魚明顯少于三倍體鯽魚的側(cè)線鱗數(shù)量，可見側(cè)線鱗數(shù)可以作為區(qū)分二倍體龍池鯽魚和三倍體鯽魚的重要指標之一。

2.4 龍池鯽魚T型標效果

被標記過的龍池鯽魚經(jīng)過3周圈養(yǎng)，統(tǒng)計其T型標標記后的成活率和脫牌率。經(jīng)過檢測后。龍池鯽魚的生理活動較往常一樣，成活率100%，1 000尾龍池鯽魚脫標12尾，脫標率為1.2%。

表1 流式細胞儀檢測龍池鯽魚的DNA含量

表2 二倍體與三倍體龍池鯽魚的形態(tài)特征

3 討論

3.1 龍池鯽魚紅細胞核DNA含量

該研究中三倍體鯽魚的DNA絕對含量為4.34（pg/N），二倍體龍池鯽魚的DNA絕對含量為3.82（pg/N）。說明三倍體龍池鯽魚的DNA絕對含量比二倍體龍池鯽魚要高。

3.2 龍池鯽魚群體的倍性

染色體數(shù)在290左右的核型分析認為同源染色體一般是兩兩配對而成的，是屬于二倍體。

該研究運用該方法測定的龍池鯽魚的DNA含量有290和330兩種數(shù)值。該研究證實了南京六合龍池的野生龍池鯽魚是由二倍體和三倍體所組成的一個混合的群體，原因可能是最初有三倍體的混入不斷的雜交繁殖所形成的，也可能是人工養(yǎng)殖的鯽魚混入，所造成的。

3.3 龍池鯽魚研究的意義

通過龍池位于南京市六合區(qū)西部，水質(zhì)肥沃，礦物質(zhì)豐富，浮游生物很多，生長出的鯽魚以頭小、背寬、體厚，肉嫩、味鮮為主要特點。由此可見，所謂的龍池鯽魚就是在龍池的特定生態(tài)環(huán)境中生長的地域性二倍體的野生鯽魚。流式細胞儀測得的DNA含量，將二倍體和三倍體分開，成功的將龍池鯽魚提純,主要目的是對野生龍池鯽魚的提純復(fù)壯，通過將其二倍體與三倍體分離，從而得到純種的龍池鯽魚，通過繁殖培育擴大魚種，推廣龍池鯽魚，讓龍池鯽魚能夠被更多市民所消費，也為后期研究龍池鯽魚的營養(yǎng)價值提供依據(jù)。