陳紅蓮 ，王永杰 ，張靜 ，鮑俊杰

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽 合肥 230031；2.水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）肉質(zhì)細(xì)嫩，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，在湖北、安徽、江蘇、浙江、湖南等十多個(gè)?。ㄊ校┻M(jìn)行廣泛養(yǎng)殖。近3年稻蝦綜合種養(yǎng)發(fā)展勢(shì)頭迅猛，安徽省克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積從2016年的46 700 hm2，迅速發(fā)展到2018年約133 300 hm2。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年全國(guó)克氏原螯蝦產(chǎn)量達(dá)13×105t，仍處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，稻蝦綜合種養(yǎng)發(fā)展空間巨大。

2006年，白斑綜合征首次在浙江舟山養(yǎng)殖克氏原螯蝦中爆發(fā)[1]。2007年，美國(guó)路易斯安那州184個(gè)螯蝦養(yǎng)殖場(chǎng)超過(guò)60%的螯蝦感染了白斑綜合征病毒（White spot syndromvirus,WSSV）[2]。近些年，WSSV在全國(guó)各地克氏原螯蝦中檢出[1,3,4-8]，患病蝦的死亡率可高達(dá)52%[3]，給該蝦的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，白斑綜合征尚無(wú)有效治療藥物，疫情一旦爆發(fā)，不可控制。該研究在安徽省合肥市、安慶市、滁州市和蕪湖市的池塘、水庫(kù)及稻田采集克氏原螯蝦進(jìn)行WSSV檢測(cè)，對(duì)稻田的水環(huán)境，蝦的養(yǎng)殖密度、產(chǎn)量及疾病發(fā)生情況進(jìn)行跟蹤調(diào)查，以期為稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦防控白斑綜合征提供參考。

1 材料和方法

1.1 克氏原螯蝦樣本采集

該研究在安徽省合肥市、安慶市、滁州市和蕪湖市6個(gè)魚(yú)塘、水庫(kù)采集野生的克氏原螯蝦、16個(gè)稻田采集養(yǎng)殖的克氏原螯蝦進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)點(diǎn)采集30只蝦，體質(zhì)量約10～20 g。活體帶回實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)采集蝦的鰓組織，1只蝦為1個(gè)樣本，放置-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 WSSV套式PCR檢測(cè)

取適量克氏原螯蝦鰓組織進(jìn)行研磨，用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit提取DNA作為PCR擴(kuò)增模板。對(duì)抽提的DNA樣本采用OIE的WSSV套式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增[9]。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.3 密度

首次養(yǎng)殖克氏原螯蝦的稻田，統(tǒng)計(jì)投放蝦苗的規(guī)格及數(shù)量。自繁蝦苗的稻田，調(diào)查上一年親蝦放養(yǎng)情況，成蝦、蝦苗的出售情況。

1.4 養(yǎng)殖水環(huán)境

9：00對(duì)采集克氏原螯蝦樣本的16個(gè)稻田離田梗60 cm，深40 cm處的水質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，采用美國(guó)手持式多參數(shù)水質(zhì)測(cè)量?jī)xYSI Proplus測(cè)量溶解氧、pH 值、水溫，用 HJ535—2009、GB7493—87方法分別檢測(cè)氨氮、亞硝酸鹽，每個(gè)稻田測(cè)定3個(gè)位點(diǎn)，計(jì)算平均值。觀察各稻田青苔、水草的生長(zhǎng)情況。

1.5 克氏原螯蝦產(chǎn)量及發(fā)病情況

本研究的稻田均為稻蝦連作種養(yǎng)模式，一年養(yǎng)殖一茬蝦，4—5月捕蝦上市，6月開(kāi)始種植水稻。統(tǒng)計(jì)蝦的銷(xiāo)售量，觀察蝦的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)蝦的死亡量，計(jì)算病死率。

2 結(jié)果

2.1 克氏原螯蝦WSSV檢測(cè)

6個(gè)魚(yú)塘、水庫(kù)采集的180個(gè)野生克氏原螯蝦樣本，首輪WSSV PCR檢測(cè)全部陰性，第二輪PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為8.89%（表1）；16個(gè)稻田采集的480個(gè)養(yǎng)殖克氏原螯蝦樣本，首輪PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為45.83%，第二輪PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為98.13%。蝦中WSSV首輪PCR檢測(cè)陽(yáng)性率≥50%的稻田有10個(gè)（表2）。

表1 魚(yú)塘、水庫(kù)野生克氏原螯蝦的采集地及WSSV PCR檢測(cè)結(jié)果

表2 稻田克氏原螯蝦的采集地及WSSV PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 密度

2、4號(hào)稻田首次養(yǎng)殖克氏原螯蝦，放養(yǎng)5~10 g規(guī)格的蝦苗1萬(wàn)尾/667 m2。13號(hào)稻田為第二年養(yǎng)殖克氏原螯蝦，稻田自繁了大量小蝦苗，4月初農(nóng)戶(hù)又放入5~10 g規(guī)格的蝦苗0.8萬(wàn)尾/667 m2，蝦養(yǎng)殖密度很高。

其他稻田均養(yǎng)殖克氏原螯蝦多年，在上一年的7—9月投放30~40 g規(guī)格的親蝦10~20 kg/667 m2。4月，5號(hào)稻田因伊樂(lè)藻過(guò)多，蝦捕撈困難，6，7，8號(hào)稻田出售蝦較少，養(yǎng)殖密度高。其他9個(gè)稻田均在4—5月及時(shí)出售成品蝦及部分蝦苗，養(yǎng)殖密度合適。

2.3 養(yǎng)殖水環(huán)境

16個(gè)稻田水中亞硝酸鹽數(shù)值均很低（數(shù)據(jù)未顯示），氨氮數(shù)值為正常范圍。5號(hào)稻田水中pH值偏高，平均值為9.17，水中溶解氧過(guò)飽和，平均值為9.04 mg/L。6號(hào)稻田水中溶解氧過(guò)飽和，平均值為13.56 mg/L。其他稻田pH值、溶解氧均處于正常范圍（表3）。5號(hào)稻田的伊樂(lè)藻占比達(dá)95%，6號(hào)稻田60%面積長(zhǎng)了大量青苔。

2.4 克氏原螯蝦產(chǎn)量及發(fā)病情況

16個(gè)稻田累計(jì)出售克氏原螯蝦均在180 kg/667 m2以下。所有稻田養(yǎng)殖蝦均出現(xiàn)不同程度死亡，其中7，8號(hào)稻田蝦的病死率為20%，5，6，13號(hào)稻田蝦的病死率高，分別為50%、60%、70%，其他稻田蝦的病死率為10%及以下（表4）。部分2，4號(hào)稻田購(gòu)買(mǎi)的蝦苗和6號(hào)稻田養(yǎng)殖的蝦有尾部起包癥狀，比例分別為 20%，20%，80%。從 5，7，8和13號(hào)稻田患病蝦的肝胰腺，6號(hào)稻田患病蝦的肝胰腺和尾部包塊內(nèi)容物分離培養(yǎng)出大量細(xì)菌（數(shù)據(jù)未顯示）。

表3 稻田水質(zhì)檢測(cè)

表4 稻田克氏原螯蝦養(yǎng)殖史、產(chǎn)量及發(fā)病情況

3 討論

該研究使用OIE的套式PCR方法檢測(cè)WSSV，靈敏度可達(dá)20個(gè)病毒粒子[9]，在疾病流行季節(jié)運(yùn)用該方法進(jìn)行檢測(cè)，能很好地反應(yīng)克氏原螯蝦攜帶WSSV的狀況。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)安徽省4個(gè)市野生的比稻田養(yǎng)殖的克氏原螯蝦攜帶WSSV率低很多，分別為8.89%、98.13%，表明野生的比養(yǎng)殖的蝦更適合作為親本進(jìn)行繁殖，獲得帶毒率更低的后代，同時(shí)也說(shuō)明了亟需加強(qiáng)稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦白斑綜合征的防控研究工作。

稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦一般采取自繁自養(yǎng)方式進(jìn)行，該蝦的繁殖期長(zhǎng)（4—10月），主要集中在5月和9月下旬到10月中旬[10-12]，導(dǎo)致稻田中蝦的規(guī)格不整齊，大量小蝦苗給養(yǎng)殖密度評(píng)估及控制帶來(lái)困難。4—5月水溫適宜，蝦生長(zhǎng)速度快[13-14]，容易出現(xiàn)高密度養(yǎng)殖狀態(tài)，因此，需要采取輪捕的方式將養(yǎng)蝦多年的稻田中大規(guī)格蝦捕撈上市，及時(shí)出售過(guò)多的蝦苗，控制蝦密度在適宜范圍內(nèi)。

該研究中16個(gè)稻田養(yǎng)殖的克氏原螯蝦均攜帶WSSV，但各稻田蝦體內(nèi)病毒復(fù)制的情況不同。特別是首輪WSSV PCR檢測(cè)陽(yáng)性率≥50%的10個(gè)稻田，不同的養(yǎng)殖管理導(dǎo)致蝦病死率差異很大。其中2，4，14，15，16 號(hào)稻田蝦病死率≤10%。14，15，16號(hào)稻田養(yǎng)蝦多年，4—5月輪捕成品蝦及部分蝦苗上市，蝦養(yǎng)殖密度合理，水質(zhì)良好，蝦的死亡率為5%。2和4號(hào)稻田首次養(yǎng)蝦，放養(yǎng)密度合理，盡管買(mǎi)進(jìn)的蝦苗20%出現(xiàn)了尾部起包的癥狀，但在用碘制劑消毒養(yǎng)殖水體，管理好養(yǎng)殖水質(zhì)的情況下，只出現(xiàn)不超過(guò)10%的病死率。而5、6、7、8和13號(hào)稻田，蝦死亡率為20%及以上。這些稻田，4月捕撈蝦少，出現(xiàn)高密度養(yǎng)殖狀態(tài)。特別是13號(hào)稻田，自繁了大量小蝦苗，4月初又放入蝦苗0.8萬(wàn)尾/667 m2，超高養(yǎng)殖密度導(dǎo)致蝦的病死率高達(dá)70%。因此，推斷密度是決定攜帶大量WSSV的克氏原螯蝦病死率高低的關(guān)鍵因素之一。周俊芳等[15]在對(duì)對(duì)蝦（約8 g，42%攜帶WSSV）進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)高密度組（80尾/150 L玻纖桶）蝦的病死率（96.9%，鹽度恒定；98.1%，鹽度突降），比低密度組（30尾/150 L玻纖桶）蝦的病死率（5.0%，鹽度恒定為2%±0.1%；26.7%，鹽度突降至0.95%±0.05%）高得多，且高密度比鹽度突變更容易造成蝦死亡。

4—5月水溫（20~28℃）適宜 WSSV 復(fù)制[17]，高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致克氏原螯蝦免疫力下降[16]，蝦體內(nèi)病毒復(fù)制速度加快。WSSV抗逆性不強(qiáng)，制備好的病毒懸液置于29~31℃5~6 h即喪失活性[3]，據(jù)此推測(cè)稻田中患白斑綜合征的蝦死亡一段時(shí)間后，病毒部分或全部失活。然而，克氏原螯蝦有同類(lèi)相互殘食習(xí)性[18]，高密度養(yǎng)殖條件下，蝦殘食加劇[19]，患白斑綜合征的蝦更容易在垂死或換殼時(shí)被其他蝦分食，使蝦群體帶毒率和帶毒量均增加，蝦的免疫力進(jìn)一步下降，容易繼發(fā)細(xì)菌感染。該研究5，6，7，8和13號(hào)稻田高密度養(yǎng)殖患病蝦的肝胰腺中均分離到大量細(xì)菌。因此，4—5月高密度養(yǎng)殖攜帶WSSV的克氏原螯蝦，容易出現(xiàn)大量死亡。

pH值、氨氮、溶解氧、亞硝酸鹽等一直被研究者及養(yǎng)殖戶(hù)認(rèn)為是影響克氏原螯蝦健康的重要水質(zhì)因子[16，20]。晴天時(shí)，光合作用強(qiáng)，過(guò)多的伊樂(lè)藻導(dǎo)致5號(hào)稻田水中pH值偏高，溶解氧過(guò)飽和，大量的青苔使6號(hào)稻田水中溶解氧過(guò)飽和。雨天時(shí)，因?yàn)橹参锏暮粑饔?，這些稻田水中的溶解氧將會(huì)被大量消耗，處于缺氧狀態(tài)。這些水質(zhì)的異常變化降低了蝦的免疫力，增加蝦的病死率。21℃時(shí)淡水水體溶解氧的飽和度約為8.8 mg/L[21]，6號(hào)稻田上午9 h水中溶解氧飽和度已達(dá)154%，其水中溶解氧將隨光照時(shí)間增加而不斷增加，推測(cè)蝦尾部起包與溶解氧過(guò)飽和相關(guān)。龍蝦（Homarus americanus）曾被報(bào)道因其孵化場(chǎng)供水裝置空氣泄漏導(dǎo)致孵化場(chǎng)水體氣體過(guò)飽和，患了氣泡病[22]。鰱、鳙和鳊能承受的極限溶解氧飽和度約為120%，草魚(yú)和鯽能承受的極限溶解氧飽和度約為130%或更高[21]。